李艳萍 张立虎 吴红雁 赵林果 萧 伟

（1.江苏医药职业学院药学院， 江苏 盐城224005； 2.江苏医药职业学院生物技术研究院， 江苏盐城224005； 3.南京林业大学化学工程学院， 江苏 南京210037； 4.江苏康缘药业股份有限公司， 江苏连云港222001）

银杏为裸子植物，是地球上唯一幸存的银杏科银杏属物种，又称为“活化石”，在我国江苏、山东等地大面积种植［1］，其叶和果实有较强的药用价值，具有敛肺气、平喘咳、止带浊等功效，目前以前者开发尤为突出，已从中分离得到50 余种黄酮、8 种内酯、5 种有机酸和聚异戊烯醇等成分，其标准提取物要求总黄酮质量分数不低于24%［2］，总内酯质量分数不低于6%。

银杏黄酮具有扩张血管、保护心肌、抗血管粥状硬化等作用，以及抗氧化、抗炎、清除自由基、延缓衰老、抗肿瘤等活性［3⁃8］；银杏内酯B 是天然产物中最好的血小板活化因子（PAF）拮抗剂，对中枢神经、心血管系统具有保护作用，对过敏反应、内分泌系统、生殖系统、免疫系统也有调节活性［9⁃14］，它们均广泛应用于相关药品、保健品的开发中。在提取银杏叶中总黄酮、总内酯时，常采用溶剂萃取法、CO2超临界流体萃取法［15］、超声波提取法［16］、柱色谱法［17］，而企业在生产过程中常采用树脂法，但两者极性上有重叠而难以同时完成；有的企业采用活性炭制备总内酯后，总黄酮、活性炭作为工业垃圾被废弃，造成资源浪费，故本实验优化这2 种成分的同步提取工艺。

1 材料

Agilent 1260 Series 型高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；Alltech 2000ES 型蒸发光散射检测器（美国奥泰公司）；SB⁃2000 型真空旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；HH⁃4 型数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）；KH3200B型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；BS⁃124S型电子天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］。银杏叶粉由江苏康缘药业股份有限公司提供，产地江苏邳州（过100 目筛），经江苏医药职业学院宋建平教授鉴定为正品。银杏内酯A、B、C 及白果内酯对照品（南京紫竹生物科技有限公司）；槲皮素、山柰酚、异鼠李素、山柰素对照品（成都曼思特生物科技有限公司）。四氯化碳、乙酸乙酯、正己烷、无水乙醇（南京化学试剂股份有限公司）。

2 方法与结果

2.1 总黄酮、总内酯粗品分离 见图1。

图1 总黄酮、总内酯粗品分离流程

2.2 供试品溶液制备

2.2.1 总黄酮 取粗品溶液（含总黄酮约5 mg，5 mL 甲醇溶解）100 μL，25%盐酸甲醇（1 ∶4）溶液稀释至1 mL，70 ℃水浴中酸水解2 h，0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.2.2 总内酯 取粗品溶液（含总内酯约5 mg，5 mL 甲醇溶解）100 μL，甲醇稀释至1 mL，超声（200 W、100 kHz）10 min，0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.3 总黄酮含有量测定

2.3.1 色谱条件 Agilent Eclipse XDB⁃C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相甲醇⁃水，梯度洗脱，程序见表1；体积流量0.8 mL／min；柱温30 ℃；检测波长360 nm；进样量10 μL；运行时间33 min。理论塔板数不低于2 500。

表1 梯度洗脱程序

2.3.2 对照品溶液制备 精密称取槲皮素、山柰酚、异鼠李素对照品适量，置于10 mL 棕色量瓶中，甲醇定容，即得（各成分质量浓度分别为420、420、380 μg／mL）。

2.3.3 线性关系考察 精密吸取对照品溶液0.5、1、1.5、2、2.5 mL，置于5 个10 mL 量瓶中，甲醇定容至10 mL，在“2.3.1” 项色谱条件下进样测定3 次。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，得槲皮素、山柰酚、异鼠李素方程分别为Y＝23 847X-526.66（R2＝0.999 7）、Y＝25 922X-552.3（R2＝0.999 7）、Y＝22 085X-440.49（R2＝0.999 8），分别在21～100、21～100、19～95 μg／mL 范围内线性关系良好。

2.3.4 测定结果 吸取萃取后的供试品溶液适量，水解后在“2.3.1” 项色谱条件下进样测定，按2015 年版《中国药典》 方法计算溶液中总黄酮含有量［（槲皮素含有量＋山柰酚含有量＋异鼠李素含有量）×稀释倍数×2.51］，再进一步计算银杏叶中其含有量［（供试品溶液中总黄酮含有量×总体积／药材总质量）×100%］。

2.4 总内酯含有量测定

2.4.1 色谱条件 Agilent Eclipse XDB⁃C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相甲醇⁃水（33 ∶67）；柱温35 ℃；进样量20 μL，运行时间50 min；Alltech 2000ES 蒸发光散射检测器（ELSD）；漂移管温度100 ℃；载气体积流量2.2 L／min。理论塔板数不低于2 500。

2.4.2 对照品溶液制备 精密称取银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、白果内酯对照品适量，置于10 mL 棕色量瓶中，甲醇定容，即得（各成分质量浓度分别为720、490、520、780 μg／mL）。

2.4.3 线性关系考察 取对照品溶液0.5、1、1.5、2、2.5 mL，甲醇稀释定容至10 mL，在“2.3.1” 项色谱条件下进样测定3 次。以溶液质量浓度对数值为横坐标（X），峰面积对数值为纵坐标（Y）进行回归，得白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C 方程分别为Y＝0.967 1X＋7.173（R2＝0.999 8）、Y＝1.451 9X＋6.873 6（R2＝0.999 2）、Y＝1.578 7X＋6.726 9（R2＝1）、Y＝1.034 5X＋6.969 4（R2＝0.999 9），分别在36～180、24.5～122.5、26～130、39～195 μg／mL 范围内线性关系良好。

2.5 HPLC 分析 见图2～3。采用2015 年版《中国药典》方法，测得总黄酮粗品萃取后槲皮素、山柰酚、异鼠李素总质量分数约为79.46%，而正交试验时药材中其范围约为0.544%～0.708%；采用归一化法，测得总内酯粗品萃取后银杏内酯A、B、C 及白果内酯总质量分数约为93.36%，而正交试验时药材中其范围约为0.100%～0.340%。

图2 总黄酮HPLC 色谱图

图3 总内酯HPLC 色谱图

2.6 单因素试验 固定料液比1 ∶20，乙醇体积分数50%，提取次数1 次，考察提取时间1、1.5、2、2.5、3 h 对提取效果的影响；固定提取时间2 h，乙醇体积分数50%，提取时间2 h，考察料液比1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30 对提取效果的影响；固定提取时间2 h，料液比1 ∶20，提取次数1 次，考察乙醇体积分数30%、40%、50%、60%、70%对提取效果的影响；固定提取时间2 h，料液比1 ∶20，乙醇体积分数50%，考察提取次数1、2、3 次对提取效果的影响。

2.7 正交试验 在单因素试验基础上，选择提取时间（A）、料液比（B）、乙醇体积分数（C）、提取时间（D）作为影响因素，总黄酮、总内酯含有量作为评价指标，计算综合评分，公式为综合评分＝0.5W1／W1max＋0.5W2／W2max（W1为总黄酮测得含有量，W1max为总黄酮最大含有量，W2为总内酯测得含有量，W2max为总内酯最大含有量），设计L9（34）正交试验优化提取工艺。因素水平见表2，结果见表3，方差分析见表4。

表2 因素水平

表3 试验设计与结果

表4 方差分析

由此可知，各因素影响程度依次为C＞B＞D＞A，其中因素C有显著影响（P＜0.05），最优工艺为A1B3C3D3，但因素A、D影响程度较小，考虑到生产成本，最终将其修正为A1B3C3D1，即提取时间1.5 h，料液比1 ∶25，乙醇体积分数60%，提取次数1 次，总黄酮、总内酯质量分数分别为0.595%、0.289%。

2.8 验证试验 按优化工艺进行3 批验证试验，测得总黄酮、总内酯平均质量分数分别为0.561%、0.315%，与预测值0.595%、0.289% 接近，表明工艺合理可靠，具有一定实用价值。

3 结论

本实验通过优化提取工艺来一体化分离制备银杏叶中总黄酮、总内酯粗品，水解前者后发现槲皮素、山柰酚、异鼠李素总质量分数达79.46%，而后者中银杏内酯A、B、C 及白果内酯总质量分数达93.36%，可为后期相关药理和临床研究提供纯度较高的样品。