王 志 谢建絮 李婉斯 葛泓钰 张永太 冯年平∗

（1.上海中医药大学， 上海201203； 2.上海市第十人民医院， 上海200072）

西黄丸出自《外科证治全生集·卷四》，由牛黄、麝香、乳香、没药4 味药材组成，用于治疗痈疽疮毒、恶性肿瘤［1⁃2］，方中麝香味辛，性温，芳香而通经络，为主药。课题组前期根据药味用量、药理作用、化学成分，对西黄丸进行了提取精制，发现经超临界CO2萃取后所得西黄方活性组分的抗肿瘤作用与原制剂相近，并且在减量（每天服用量约为原处方量的1／15）的同时未减效。

本实验以麝香主要活性成分麝香酮为指标，将从药动学角度探讨西黄方配伍的协同作用，同时比较方中麝香在正常、乳腺癌癌前病变大鼠体内药动学的差异，以期为探索其配伍机制、开发相关新剂型提供依据。

1 材料

1.1 试剂与药物麝香酮（批号 110719⁃201215）、正十七烷（批号51578）对照品（中国食品药品检定研究院）；7，12⁃二甲基苯并蒽（DMBA，美国Sigma 公司，批号D3254）；肝素钠注射液（上海上药第一生化药业有限公司，批号151802020A）；醋酸甲羟孕酮片（上海信谊天平药业有限公司，批号170611）；戊酸雌二醇片（拜耳医药保健有限公司，批号372A）。人工麝香（北京联馨药业有限公司，批号2016VR116）；体外培育牛黄（武汉健民大鹏药业有限公司，批号170701）；乳香、没药（上海虹桥药业有限公司中药饮片厂），以上药材均经上海中医药大学中药学院生药学教研室吴靳荣副教授鉴定为正品。西黄方为自制（根据2015 年版《中国药典》 西黄丸处方，称取体外培育牛黄、人工麝香各15 g，粉碎成细粉后过60 目筛；称取乳香、没药各550 g，粉碎成细粉后过24 目筛，在35 MPa、45 ℃下超临界CO2萃取3 h，提取物收率为6%～7%。将上述药材粉末混合过筛，即得）。

1.2 仪器 Agilent 7000 GC⁃MS 联用仪（美国Agi⁃lent Technologies 公 司）；GENIUS 3 涡旋混合器（德国IKA 公司）；Milli⁃Q 纯水仪（美国Millipore公司）；DL⁃360 超声波清洗器（上海之信仪器有限公司）；Minispin 离心机（德国Eppendorf 公司）；JA31002 电子天平（上海精天电子仪器有限公司）；H550S 显微镜（日本Nikon 公司）。

1.3 动物 SPF 级健康雌性SD 大鼠18 只，6 周龄，体质量140～160 g，由上海中医药大学实验动物中心提供，动物生产许可证号SCXK（沪）2013⁃0016。大鼠在温度20～22 ℃、相对湿度45%～65%，光照／黑暗12 h／12 h 条件下饲养，自由进食饮水，适应性饲养1 周后开始实验。

2 方法与结果

2.1 造模、分组及给药 参考文献［3］报道。实验第1 天，大鼠灌胃给予溶有二甲基苯蒽（DMBA）的芝麻油（0.1 g／kg），从造模第2 周开始以5 d 为1 个周期，灌胃给予雌激素、孕激素［第1～3 天戊酸雌二醇片（14.1 mg／kg），第4 天醋酸甲羟孕酮片（19.8 mg／kg），第5 天停止给药］至第9 周造模结束。大鼠随机分为西黄方正常组、西黄方模型组，均灌胃给予相应活性组分［891.8 mg／kg 乳香及没药提取物、122 mg／kg 牛黄、122 mg／kg 麝香（含2.73 mg／kg 麝香酮）］。

2.2 指标检测

2.2.1 体征 西黄方正常组大鼠毛色光泽，精神状态较佳；西黄方模型组大鼠在造模后期饮食量下降，粪便小而少，毛色沉暗、发黄，尾呈棕黄色并有鳞片出现，乳头有增大趋势。

2.2.2 体质量 图1 显示，西黄方正常组大鼠体质量稳定增长；西黄方模型组大鼠在造模6 周后体质量增长缓慢，从第7 周至造模结束后低于西黄方正常组（P＜0.05）。

图1 大鼠体质量变化曲线Fig.1 Changing curves for rat body weights

2.2.3 乳头直径 一般大鼠胸腹部第3～5 对乳房的发育比较完全［4］，容易暴露，故本实验观察该处乳头直径的变化。图2 显示，造模前后西黄方正常组大鼠乳头直径无明显变化（P＞0.05），而造模后西黄方模型组大鼠第3 对右侧、第5 对双侧乳头直径增大（P＜0.05）。

2.2.4 乳腺组织形态 造模结束后随机取出各组大鼠第3、5 对乳腺组织，置于10%福尔马林中固定，脱水，石蜡包埋，制片，HE 染色，显微镜下观察其形态。图3 显示，西黄方正常组大鼠乳腺组织未见明显病理变化；西黄方模型组大鼠乳腺组织增生，腺泡分界模糊，导管上皮细胞增生显著，轻度异形，但整体结构未见肿瘤的浸润性扩张，根据2012 年版WHO 乳腺肿瘤组织学分类标准［5］，可判断为非典型增生。

图2 造模前后大鼠乳头直径比较Fig.2 Comparison of rat nipple diameters before and after modeling

图3 大鼠乳腺组织HE 染色（×100）Fig.3 HE staining of rat breast tissues（×100）

2.3 麝香酮含有量测定

2.3.1 GC⁃MS 条件

2.3.1.1 色谱 Agilent HP⁃5 毛细管色谱柱（0.32 mm×0.25 μm，30 m）；进样口温度260 ℃；程序升温（初始60 ℃，5 ℃／min 升至160 ℃，10 ℃／min 升 至240 ℃，维持2 min，分析时间30 min）；载气氦气，体积流量1 mL／min；不分流进样，进样量2 μL。

2.3.1.2 质谱 EI 源（电压70 eV）；离子源温度230 ℃；MRM 扫描模式；正十七烷以m／z240 为前级离子，m／z99、71 为产物离子，碰撞能量20 eV；麝香酮以m／z238 为前级离子，m／z85、67 为产物离子，碰撞能量30 eV。

2.3.2 溶液制备

2.3.2.1 对照品溶液 精密称取麝香酮对照品适量，加乙酸乙酯⁃二氯甲烷（8 ∶2）混合溶液制成含1.031 4 mg／mL 该成分的溶液，即得。

2.3.2.2 内标溶液 精密称取正十七烷对照品适量，加乙酸乙酯⁃二氯甲烷（8 ∶2）混合溶液制成含2.994 μg／mL 该成分的溶液，即得。

2.3.3 血浆样品处理 精密吸取大鼠血浆300 μL，加入20 μL 内标溶液，振荡混匀，加入乙酸乙酯⁃二氯甲烷（8 ∶2）混合溶液500 μL，涡旋5 min后静置5 min，12 000 r／min 离心10 min，分取有机相，残余样品加入500 μL 混合溶液同法萃取，将2 次萃取的有机相富集，常温下N2吹干，分析前用50 μL 乙酸乙酯复溶，涡旋5 min，12 000 r／min 离心10 min，取40 μL 上清液进样。

2.3.4 专属性试验 取空白血浆加内标、对照品加内标、给药0.5 h 后血浆样品溶液，在“2.3.1”项条件下进样测定，结果见图4。由此可知，麝香酮、内标（正十七烷）保留时间分别为26.55、24.36 min，血浆中杂质对测定无干扰。

2.3.5 线性关系考察 取对照品溶液适量，乙酸乙酯⁃二氯甲烷（8 ∶2）混合溶液依次稀释至322.31、161.16、80.58、40.29、20.14 ng／mL，向300 μL 大鼠空白血浆中加入上述稀释液及内标溶液各20 μL，按 “2.3.3” 项下方法处理，在“2.3.1” 项条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），麝香酮、内标（正十七烷）峰面积比值为纵坐标（Y）进行回归，得方程为Y＝0.219 2X＋0.278 1（r＝0.999 5），在1.34～21.48 ng／mL范围内线性关系良好。

图4 麝香酮GC⁃MS 色谱图Fig.4 GC⁃MS chromatograms of muscone

2.3.6 精密度试验 取对照品溶液适量，加入空白血浆制成1.34、10.74、21.48 ng／mL 质控样品溶液，每个质量浓度平行5 份，按“2.3.3” 项下方法处理，同一天在“2.3.1” 项条件下进样测定5 次，测得日 内精密 度 RSD 分别为0.97%、1.56%、2.13%；同法连续测定3 d，每天1 次，测得日间精密度RSD 分别为5.05%、1.28%、7.36%，表明该方法精密度良好。

2.3.7 准确度试验 取对照品溶液适量，加入空白血浆制成1.34、10.74、21.48 ng／mL 质控样品溶液，每个质量浓度平行5 份，按“2.3.3” 项下方法处理，在“2.3.1” 项条件下进样测定，测得准确度为77.31%～116.51%，表明该方法准确度良好。

2.3.8 提取回收率及基质效应 取对照品溶液适量，空白血浆制成1.34、10.74、21.48 ng／mL质控样品溶液，每个质量浓度平行5 份，按“2.3.3” 项下方法处理，在“2.3.1” 项条件下进样测定，得到对照品、内标峰面积比值A1；取大鼠空白血浆300 μL，按“2.3.3” 项下方法处理，上清液中加入对照品、内标溶液，振荡混匀，常温下N2吹干，分析前加入50 μL 乙酸乙酯复溶，涡旋5 min，12 000 r／min 离心10 min，取40 μL上清液，在“2.3.1” 项条件下进样测定，得到对照品、内标峰面积比值A2；取含对照品的甲醇溶液，在“2.3.1” 项条件下进样测定，得到对照品、内标峰面积比值A3。以A1、A2比值为提取回收率，A2、A3比值为基质效应，测得不同质量浓度对照品溶液的提取回收率为91.76%～103.77%，基质效应均达到80%以上，表明该方法满足相关分析要求。

2.3.9 稳定性试验 取对照品溶液适量，加入空白血浆制成1.34、10.74、21.48 ng／mL 质控样品溶液，室温下放置24 h 后按“2.3.3” 项下方法处理，在“2.3.1” 项条件下进样测定，测得麝香酮峰面积RSD 小于5%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.4 药动学研究 将大鼠随机分为麝香组、西黄方正常组、西黄方模型组，灌胃给药30 d，每天1 次，麝香组给予人工麝香（122 mg／kg，含2.73 mg／kg麝香酮），西黄方正常组、西黄方模型组给予相应活性组分［891.8 mg／kg 乳香及没药提取物、122 mg／kg牛黄、122 mg／kg 麝香（含2.73 mg／kg 麝香酮）］。第30 天给药后，于0.083、0.25、0.5、1、1.5、2、4、6、8、24 h 眼眶后静脉丛取血各约0.5 mL，置于肝素钠溶液处理过的离心管中，按“2.3.3” 项下方法处理，在“2.3.1” 项条件下进样测定，计算麝香酮血药浓度。

通过DAS2.0 软件中的非房室模型计算主要药动学参数，SPSS 21.0 软件进行统计学分析，组间比较若方差齐，则采用t检验；若方差不齐，则采用秩和检验，结果见表1、图5。由此可知，麝香组在0.8 h 就达到Tmax，随后迅速分布和消除，4 h后基本 无法测 出；西黄方 正常组 AUC0～t、AUC0～∞、MRT0～t、MRT0～∞、t1／2z高于麝香组（P＜0.05），CLz／F降低（P＜0.05）；与西黄方正常组比较，西黄方模型组AUC0～t、AUC0～∞、MRT0～t升高（P＜0.05），CLz／F降低（P＜0.05）。

3 讨论

从药动学角度开展复方配伍研究，对阐明中医药理论内涵、实现中药复方现代化具有重要意义。随着对疾病发生机制的揭示，关注药物体内作用过程，比较正常、病理状态下机体药动学差异，是指导临床合理用药、相关剂型研发的基础。

表1 麝香酮主要药动学参数（， n＝6）Tab.1 Main pharmacokinetic parameters for muscone（， n＝6）

表1 麝香酮主要药动学参数（， n＝6）Tab.1 Main pharmacokinetic parameters for muscone（， n＝6）

注：与麝香组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01；与西黄方正常组比较，▲P＜0.05。

图5 麝香酮血药浓度⁃时间曲线Fig.5 Plasma concentration⁃time curves for muscone

目前，已有关于西黄丸可逆转大鼠乳腺癌癌前病变的报道，给药方式为造模后连续灌胃水提液30 d［6］。在西黄方体内药动学研究中，若采用单剂量给药则难以客观描述该方对机体的影响，而且乳腺癌癌前病变的中医药治疗是一个长期过程［7］，故本实验采用多剂量灌胃给药，旨在更接近动物真实的机体状态。

临床上许多药物长期使用时，会产生蓄积现象。本实验发现，灌胃给药30 d 后麝香组、西黄方正常组麝香酮t1／2分别为0.84、4.01 h，表明多剂量给药难以造成该成分在正常大鼠体内的蓄积；与西黄方正常组比较，西黄方模型组中麝香酮t1／2较高，虽然差异无统计学意义，但在后期相关新剂型设计中仍需加以重视。

结果显示，大鼠灌胃给予麝香后体内药动学趋势与文献［8⁃10］报道的麝香酮单体基本一致，均表现为吸收快、消除快。目前，有关麝香在复方中的体内药动学研究较少，对比现有的麝香保心丸［11］、片仔癀［12］报道发现，2 种制剂中麝香酮MRT0～t、t1／2、Tmax有所延长，与本实验结果一致，即复方配伍可影响该成分在大鼠体内的药动学，使其吸收程度增加，体内清除减慢，生物利用度升高。课题组前期采用大鼠在体单向肠灌流模型，从吸收角度对麝香单味药及西黄方的肠吸收特征进行了研究，发现西黄方中麝香酮的吸收在不同肠段有递增趋势，其中十二指肠Ka、Papp更显著［13］，也是该成分最佳吸收肠段［14］；本实验从药动学角度出发，进一步证明了复方配伍的协同作用。

另外，与西黄方正常组比较，西黄方模型组麝香酮滞留时间延长，清除率降低，AUC0-t约为正常组的170%，表明在DMBA 联合雌激素、孕激素制备大鼠乳腺癌癌前病变模型时，可能对药物本身产生了作用，从而影响其体内过程，具体机制还有待进一步研究。