李永辉，崔佳，赵培，路永刚

1 河北省疾病预防控制中心,石家庄050051；2 河北省人民医院

近年来研究发现，空气中可吸入细颗粒物(PM2.5)是加速动脉粥样硬化(AS)发生发展及导致冠心病发病的重要原因，引起了广泛的社会关注[1]。随着研究不断深入，逐渐发现AS的病理变化存在变质、渗出和增生等炎症的基本特征，病变过程中始终都有各种炎症细胞和大量炎症介质的参与[2]。研究认为，PM2.5能够避开呼吸系统屏障进入血液循环，并对人体的免疫系统造成一定影响[3，4]。循环白细胞(主要是单核细胞和巨噬细胞)是先天免疫系统的组成部分，循环中的单核细胞迁移到病变血管内膜处分化为巨噬细胞，巨噬细胞分泌功能的异质性改变决定了AS的进展。巨噬细胞可分为两个亚群：第一个亚群由典型激活的巨噬细胞(M1)组成，可释放大量炎症细胞因子[如诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、白细胞介素12(IL-12)等]，引起白细胞募集、活化、分化，具有促进AS斑块发展的作用；第二个亚群由交替激活的巨噬细胞(M2)组成，具有抗炎[如精氨酸酶1(Arg-1)、CD206]和抗AS作用[5，6]。因此，M1型与M2型巨噬细胞的平衡对AS的发展或抑制至关重要。2018年1月～2019年12月，我们观察了PM2.5能否诱导巨噬细胞M1/M2表型转化从而促进AS的发生发展。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 SPF级Apo E-/-小鼠，8周龄，体质量(20±2)g，购自卡文斯实验动物有限公司(中国常州),饲养于河北省人民医院临床研究中心SPF级动物房(温度20～24 ℃，湿度45%～55%)，每笼5～6只。高脂饲料(含21%脂肪、19.5%酪蛋白和1.25%胆固醇,江苏美迪森生物医药有限公司)；Movat染液(Servicebio公司)，天狼星红染液(Sigma公司)；MAC-2、β-actin检测试剂盒(Santa Cruz 公司)，山羊抗兔IgG(Abcam公司)，DAB显色试剂盒(北京中杉金桥公司)；基因引物由英潍捷基贸易有限公司合成，荧光定量PCR检测试剂盒(RR820A，大连宝生物公司)；多用途低温离心机(Eppendorf 公司)，倒置光学显微镜(DMI3000B)，组织包埋机(EG11508)、石蜡切片机(RM2135)均购自Leica公司，全自动凝胶成像系统(8845-S，美国Bio-Rad公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 PM2.5混悬液制备 采用TH-150D型智能中流量空气总悬浮颗粒物采样器，24 h连续中流量采样进行PM2.5收集。将收集的PM2.5用液氮冷冻干燥成粉末，于黑暗中4 ℃下储存。每天应用前将10 mg的PM2.5粉末悬浮在4.8 mL生理盐水中混匀，即为PM2.5混悬液。经检测混悬液中重金属的成分主要为铝(Al)、钒(V)、铁(Fe)、锰(Mn)、硒(Se)、银(Ag)，其含量分别为0.273 02、0.002 16、0.446 58、0.016 04、0.000 68 μg/L。

1.2.2 动物分组与造模处理 将Apo E-/-小鼠随机分为两组各16只，均给予高脂饲料饲养8周；同时，PM2.5组和对照组分别气管滴注PM2.5生理盐水混悬液、生理盐水0.3 mL，1次/d；PM2.5用量参考2017年石家庄地区正常成人每天PM2.5吸入量(65 μg/m3)，数据来自国际环保组织绿色和平2018年1月10日发布的《2017年中国365个城市PM2.5浓度排名》。

1.2.3 小鼠全血重金属含量测定 8周后小鼠眼球取血，采用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS,Thermo Fisher Scientific, USA)测定全血的重金属含量(Al、V、Fe、Mn、Se、Ag)。

1.2.4 主动脉标本取材与处理 眼球取血后，在无菌条件下以3%水合氯醛腹腔麻醉并固定；打开小鼠胸腔，在生理压力下应用冰生理盐水灌流直至肝脏发白；充分暴露主动脉，剥离主动脉周围结缔组织；切取主动脉根部，用4%多聚甲醛固定后石蜡包埋，连续切片，用于Movat染色、天狼星红染色及免疫组化染色；同时快速分离降主动脉，保存于液氮中，用于实时荧光定量PCR检测。

1.2.5 主动脉根部斑块面积及成分分析 将主动脉根部切成5 μm厚的石蜡切片，分成三部分。第一部分进行Movat染色，以染色面积评估斑块大小；第二部分行天狼星红染色后，评价斑块内胶原含量变化，以染色面积占斑块面积百分比表示；最后一部分行免疫组化染色，以抗人MAC-2抗体免疫组化染色评估斑块内的巨噬细胞数量，以人β-actin抗体免疫组化染色评估斑块内平滑肌细胞数量。用偏振光显微镜采集天狼星红染色图像，正置显微镜采集Movat染色和免疫组化染色图像，均以Image Pro Plus6图像分析软件测算斑块面积、分析阳性区域平均光密度值。

1.2.6 降主动脉斑块内巨噬细胞表型标志性因子基因检测 使用TRIzol两步法抽提降主动脉的总RNA，按照逆转录试剂说明书进行实时荧光定量PCR。扩增条件：94 ℃ 40 s，70 ℃ 5 s，60 ℃ 15s ，72 ℃ 10 s，40个循环；以GAPDH作为内参，用2-ΔΔCt相对定量法表示基因相对表达量。斑块内巨噬细胞表型标志性因子及内参基因荧光定量PCR反应引物序列，见表1。

2 结果

2.1 两组全血中重金属含量比较 PM2.5组全血中重金属含量均较对照组升高，其中Al、V、Fe含量差异有统计学意义。见表2。

表1 降主动脉斑块内巨噬细胞表型标志性因子及内参基因引物序列

2.2 两组主动脉根部斑块面积及成分比较 与对照组比较，PM2.5组主动脉根部斑块面积增大，斑块中巨噬细胞数量增加、胶原含量降低(P均<0.05)，而平滑肌数量无明显变化。见表3。

表2 两组全血中重金属含量比较

表3 两组主动脉根部斑块面积及成分比较

2.3 两组降主动脉斑块内M1和M2型巨噬细胞标志性因子基因表达比较 与对照组比较，PM2.5组M1型巨噬细胞标志性因子iNOS、IL-12 mRNA表达增加，而M2型巨噬细胞标志性因子CD206、Arg-1 mRNA表达下降(P均<0.05)。见表4。

表4 两组降主动脉斑块内M1和M2型巨噬细胞标志性因子基因表达比较

3 讨论

目前，以AS为病理基础的心脑血管疾病成为人类死亡的首因。近年来，AS发病机制的炎症学说成为研究热点，AS被认为是一种在动脉管壁发生以脂质堆积和纤维斑块形成为特征的慢性、低水平炎症性疾病。循环白细胞(主要是单核细胞和巨噬细胞)是先天炎症免疫的主要组成部分，是抵御异物的第一道防线[7，8]。近年来，大气污染对AS患者的不利影响逐渐引起了人们的重视。研究发现，短期暴露于高浓度或长期暴露于低浓度PM2.5是AS进展的一个危险因素[9]，但其作用机制尚未完全阐明。

研究表明，巨噬细胞亚群M1/M2比例失衡能够影响AS的发展方向以及斑块的稳定性。M1型巨噬细胞释放的炎症因子，能加速AS斑块的形成进展及斑块不稳定性。M2型巨噬细胞既能发挥抗炎作用，又能进一步抑制AS发展。在AS斑块损伤的早期，M2型巨噬细胞大量浸润，斑块趋于稳定；然而，在斑块破裂时期，M1型巨噬细胞大量浸润，促使炎症因子分泌增加，使斑块稳定性降低。iNOS能够在活化的M1型巨噬细胞中高表达，并与钙调蛋白结合产生大量的活性氧，其与周围的NO自发反应形成ONOO。ONOO作为一种强氧化因子能够造成氧化低密度脂蛋白的形成与聚集、内皮细胞损伤以及泡沫细胞形成。而且，过度产生的iNOS和ONOO都能激活经典的NF-κB通道，诱导产生更多的细胞因子和其他急性期反应物，进一步放大炎症反应并损伤内皮功能[10],从而加速AS的发生与进展。IL-12具有调节Th1和Th2细胞之间平衡的作用，能诱导合成IFN-γ和TNF-α等炎症因子，增强细胞免疫应答。研究表明，活化M1型巨噬细胞产生的IL-12可促进CD4+T细胞分泌干扰素γ，以加重机体炎症反应，促进动脉硬化斑块破裂和血栓形成[11]。Arg-1能够导致免疫失活，并且在脂多糖和病原体所致炎症反应中发挥重要作用。多项研宄表明，该酶能够促进人主动脉平滑肌细胞的增殖[12]。因此，Arg-1可能是一个新的抗AS候选基因[13]。CD206又称甘露糖受体C1型，是一种模式识别受体，是活化M2型巨噬细胞的表面标志[14]。其具有内吞和噬菌作用，与抗原提呈、信号转导、先天性宿主免疫和后天适应性免疫反应有关[15]。

本研究发现，PM2.5作用后Apo E-/-小鼠主动脉斑块面积增大，斑块内巨噬细胞数量增多而胶原含量减少；这提示PM2.5暴露增强了血管内皮的免疫炎症反应，这种免疫炎症反应在PM2.5持续刺激下可能持续发生[16]，从而加速了AS的进程。进一步研究发现，在用PM2.5处理的Apo E-/-小鼠动脉斑块中M1型巨噬细胞标志因子表达升高，M2型巨噬细胞标志因子表达降低。这表明PM2.5能促进巨噬细胞转型为M1型，从而促进动脉粥样斑块发展；并能抑制巨噬细胞转型为M2型，降低斑块中平滑肌细胞和胶原等的合成，从而降低了斑块的稳定性。因此，我们认为PM2.5暴露能够促进Apo E-/-小鼠模型AS的进展，其可能的机制是血管内皮炎症增强和巨噬细胞向M1型倾斜。