钱星文， 伍小妹， 谭转换

(东方药林药业有限公司，广东 广州 510515)

骨质疏松症(OP)是一种骨骼系统疾病，多由骨量减少、骨骼微细结构破坏、骨骼脆性增加、易于骨折等原因引起[1]。在人口寿命延长、老年人口占比必然上升的情况下[2]，OP成为继心血管疾病、糖尿病之后的第3种常见多发的慢性疾病[3]，已成为一个全球性的问题[4]。本文研究一种具有增加骨密度作用的中药保健食品，来源于南方医科大学的名医验方，主要用于增强骨密度，方中所用原料均在既是食品又是药品的保健品名单中[5]，本实验拟对东方药林牌骨碎补马鹿茸片进行毒理学实验，进一步研究东方药林牌骨碎补马鹿茸片的安全性，为组方的安全使用提供依据。

1 材料和试剂

1.1 实验样品

东方药林牌骨碎补马鹿茸片(中元片)，由淫羊藿、骨碎补、山茱萸、马鹿茸为原料，添加微晶纤维素、淀粉、硬脂酸镁、润湿剂聚维酮 K30制备而成，每日服用量为4.32 g/60 kg(体质量，下同)，送检样品量为5.0 kg(为中试验证生产中的未添加辅料的中间产品，批号为20170503)，棕色粉末，相当于成品样品9.72 kg，样品每日服用剂量为2.22 g/60 kg，东方药林药业有限公司提供。

1.2 实验动物

SPF级昆明种小鼠和Wistar大鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号为SCXK(京)2016-0011。实验过程中对动物的处置符合实验动物伦理学规定。

1.3 仪器和试剂

XS6001S动物秤[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；GR85DA高压灭菌锅[致微(厦门)仪器有限公司]；TC20细胞计数仪(美国BIO-RAD公司)；VS-1300L-U超净工作台(苏州安泰公司)；SPX-250智能生化培养箱(金坛市医疗仪器厂)、OLYMPUS 显微镜(OLYMPUS公司)；AU480 全自动生化分析仪(Beckmen Coulter公司)； XT-2000i五分类血球计数仪(Sysmex公司)。

1.4 方法[6]

1.4.1 小鼠经口急性毒性实验(最大耐受量法，MTD法) 选用雌雄各半20只18～22 g SPF级昆明种小鼠，禁食16 h，以15.0 g/kg的剂量，给予质量浓度为0.375 g/mL、灌胃量为0.20 mL/10 g的样品溶液2次，时间间隔为6 h，给药后连续观察14 d。记录中毒表现及死亡情况。

1.4.2 大鼠经口急性毒性实验(最大耐受量法) 选用雌雄各半20只180～220 g SPF级Wistar大鼠，禁食16 h，以15.0 g/kg的剂量，给予质量浓度为0.375 g/mL、灌胃量为2.0 mL/100 g的样品溶液2次，时间间隔为6 h，给药后连续观察14 d。记录中毒表现及死亡情况，判断受试物的急性毒性。

1.4.3 Ames实验 采用经鉴定符合要求的鼠伤害沙门氏菌组氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102 4株试验菌株进行实验。用多氯联苯(PCB)诱导大鼠后制备的肝匀浆(S9)作为体外代谢活化系统。受试物质量浓度分别为50、10、2、0.4、0.08 mg/mL。实验设0、8、40、200、1 000、5 000 μg/皿6个剂量组和阳性对照组。在顶层琼脂中加入0.1 mL试验菌株增菌液、0.1 mL受试物和0.5 mL S9混合液(当需要代谢活化时)，混匀后倒入底层培养基平板上，每组均做3个平行样。37 ℃培养48 h，计数每皿回变菌落数。若受试物的回变菌落数是空白对照菌落数2倍以上、具有剂量-反应关系者，判定为阳性。整套实验在相同条件下重复进行1次。

1.4.4 小鼠骨髓细胞微核实验 采用间隔24 h 2次灌胃法进行实验。用雌雄各半的50只体质量25～30 g小鼠，随机分为5组，每组10只，以40 mg/kg剂量的环磷酰胺作为阳性对照，腹腔注射给药，给药量为0.1 mL/10 g。实验组样品剂量设定为0、2.5、5.0、7.5 g/kg，称取样品加蒸馏水调配成浓度分别为0、0.125、0.250、0.375 g/mL的样品溶液，灌胃量为0.2 mL/10 g。于末次给样品溶液6 h后，颈椎脱臼处死动物，取胸骨骨髓用小牛血清稀释涂片，甲醇固定，Giemsa染色。在光学显微镜下，每只动物计算1 000个嗜多染红细胞(PCE)，微核发生率以含微核的PCE千分率计，并用泊松分布方法进行数据统计，并计算PCE/NCE(成熟红细胞)比例。

1.4.5 小鼠睾丸染色体畸变实验 用25只体质量25～30 g的性成熟小鼠，随机分成5组，每组5只，阳性对照组给予2.0 mg/kg剂量的丝裂霉素，给药量为0.1 mL/10 g，每天腹腔注射给药1次，连续2 d。实验组样品剂量设定为0、2.5、5.0、7.5 g/kg，取样品加蒸馏水分别调配成浓度为0、0.125、0.250、0.375 g/mL的样品溶液，灌胃量均为0.2 mL/10 g，每日灌胃1次，连续5 d，于首次给予受试物后的第13天，5组动物同时腹腔注射给予6 mg/kg剂量的秋水仙素1次，6 h后处死，取双侧睾丸制片，Giemsa染色，每组分析5只动物的染色体，每只动物分析100个中期相细胞，计算睾丸染色体畸变发生率(以百分率计)。

1.4.6 亚急性毒性实验 选用体质量60～80 g SPF级Wistar大鼠80只，雌雄各半，随机分为3个样品组及对照品组，每组20只，样品饲喂剂量设计为：0、0.93、1.85、3.70 g/kg(分别相当于未去除辅料成品人拟用剂量的0倍、25倍、50倍、100倍)，动物单笼喂养，自由饮食。连续30 d观察实验动物的一般情况，实验结束禁食16 h后，处死动物并检查实验动物的体质量、血液指标、生化指标以及脏器及胸、腹腔大体病理变化。各组数据均采用SPSS19.0进行统计，方差分析方法进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 经口急性毒性实验

实验结果显示，14 d实验期内未见明显的中毒表现和动物死亡，各主要脏器亦未见异常，说明受试物对两种性别的大、小鼠的经口最大耐受剂量(MTD)均大于15.0 g/kg，根据急性毒性分级，东方药林牌骨碎补马鹿茸片属无毒类物质。

2.2 Ames实验

样品各剂量组回变菌落数均未超过空白对照菌落数2倍；对鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA100、TA102 4株实验菌株，加与不加S9，回变菌落数均未超过空白对照组菌落数的2倍，Ames实验中未见剂量-反应关系，实验结果为阴性，未出现基因突变情况。

2.3 小鼠骨髓细胞微核实验

由表1可见，样品各剂量组微核率与阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，而环磷酰胺组与阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，说明东方药林牌骨碎补马鹿茸片小鼠骨髓细胞微核实验结果为阴性。

2.4 小鼠睾丸染色体畸变实验

样品各剂量组小鼠睾丸染色体畸变发生率均为0，与阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，而丝裂霉素阳性对照组小鼠睾丸染色体畸变发生率为0.3%，与阴性对照组相比较差异有统计学意义(P<0.05)。说明东方药林牌骨碎补马鹿茸片不会导致小鼠睾丸染色体畸变产生。

2.5 亚急性毒性实验结果

2.5.1 一般情况观察 以0.93、1.85、3.70 g/kg的剂量样品饲料喂饲大鼠30 d期间，动物未出现拒食现象，一般情况表现良好。各组随机选取10只动物的每周食物利用率、总食物利用率、体质量和增重与对照组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，详见图1～图4。

图1 实验期间大鼠的体质量变化

图2 实验期间大鼠每周的进食量变化

图3 实验期间大鼠每周食物利用率

2.5.2 受试物对大鼠血液学指标的影响 由表2、3可见，实验末期血液学的各项指标中，仅雌性动物中剂量组红细胞计数明显高于对照组(P<0.05)，但均在本检测单位正常值范围内。其余各剂量组的各项指标与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.5.3 受试物对大鼠生化指标的影响 由表4可见，实验末期，各剂量组实验动物的各项生化指标均在本检测单位正常值范围内，各项指标与空白对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.5.4 受试物对大鼠脏器的影响 受试物各剂量组动物的大体解剖检查未发现异常和明显病变，脏器质量及脏体比值与空白对照组比较，差异无统计学意义(表5、6)(P>0.05)。

2.5.5 组织学检查结果 试验结束时，对各剂量组实验动物进行大体检查，通过镜下观察高剂量组与对照组，未发现与样品相关的病理组织学改变，因此，选择高剂量组和对照组，进行肝、肾、胃、十二指肠、脾脏、睾丸和卵巢的组织学检查。个别受检动物，肝脏汇管区可见少量小圆形炎细胞浸润(对照组3/20，高剂量组2/20)、肾间质可见少量小圆形炎细胞浸润(对照组1/20，高剂量组2/20)，但两组2种病变例数之间无显著性差异，提示所出现的病变与受试物无关，可能是动物的自发病变。除此之外，胃、十二指肠、脾脏、睾丸和卵巢中均未见异常的病理改变，各剂量组动物脏器均未发现由受试物引起的损害性改变。

图4 实验期间大鼠的总增重、总进食量、总食物利用率变化

表2 受试物对大鼠血液学指标的影响Table 2 Effect of test substance on hematological indexes in

表3 受试物对大鼠白细胞分类的影响

表4 受试物对大鼠生化指标的影响Table 4 Effect of test substance on blood biochemical indexes in

表5 受试物对大鼠脏器质量的影响

表6 受试物对大鼠脏体比的影响

3 讨论

东方药林牌骨碎补马鹿茸片对2种性别的大、小鼠最大耐受剂量(MTD)均大于15.0 g/kg；3项遗传毒性实验结果均为阴性；30 d喂饲试验期间，各组动物体质量、增重、食物利用率及脏体比值与对照组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；血液学指标、生化指标均在本检测单位正常值范围内；大体解剖未发现与受试样品相关的病理组织学改变。综上所述，本产品对大、小鼠细胞内的遗传物质无致突变作用、无遗传毒性和亚急性毒性，根据国家卫生部相关分级标准判断，东方药林牌骨碎补马鹿茸片属于无毒级，是一种食用安全的保健食品。

骨碎补马鹿茸片以淫羊藿、骨碎补、山茱萸、马鹿茸四味经典的补肾中药材为主要原料，研究发现，补肾中药具有促进成骨细胞的骨形成、抑制碎骨细胞的骨吸收的作用，能通过多种途径防治骨质疏松症[7]。方中淫羊藿主要含有淫羊藿苷、总黄酮等生物活性成分[8]；淫羊藿治疗股骨头坏死具有多成分、多靶点的特点，其主要通路不仅直接参与骨重建的细胞增殖、凋亡及分化，调节成骨、破骨代谢平衡，还通过调节免疫、炎症及应激反应等干预和影响骨微环境以达到控制疾病发生发展的目的，与目前治疗股骨头坏死的作用机制相符合[9]。补骨脂活性成分主要有香豆素类、黄酮类、萜酚类等，是抗骨质疏松的主要活性物质，具有促进成骨细胞的分化、增殖，促进骨形成的作用[10-11]。山茱萸的现代研究显示，山茱萸总苷可调节骨质疏松大鼠骨组织TRPV6、TRPV5、通道蛋白表达，改变TRPV6/TRPV5倍比关系，影响成骨细胞和破骨细胞功能，促进成骨方向的骨代谢转变及提高骨密度[12]。鹿茸具有骨生长因子，能促进伤口愈合、组织修复，可能对股骨头缺血性坏死具有治疗作用，现代实验研究结果提示鹿茸粉能通过增加骨形成、改善脂肪代谢和增加血管形成来治疗激素诱导性股骨头坏死[13]。以上内容提示本产品具有改善骨质疏松症、增强骨密度的作用，本产品的研发顺应了人口老龄化的加剧、骨质疏松症多发的社会问题现状，和如今社会对骨质疏松症的高度重视、药物治疗可能引起严重副作用、价格高等问题，通过合理地摄入增强骨密度功能食品来预防和延缓骨质疏松的发生和发展、促进人体健康必不可少，可见本产品具有良好的开发前景，本研究也进一步证实了产品的安全性，为本产品的增强骨密度的功效及作用研究提供良好基础，加速其研发速度，以降低骨质疏松的发生和发展。本产品的研发理念为针对男女生理构造和需要的不同而研发出男性专用的中元片和女性专用的欣月片，而要更好地确定本产品在增加骨密度、预防骨质疏松发生的作用靶点和对男女之间是否存在明显区别，还需要更深入的研究和探索，为产品的更好应用提供证据。