张 奎，韩永魁，岳云飞，申晓彧

巨噬细胞泡沫化是早期动脉粥样硬化病变脂纹、脂斑主要成分，减少细胞内胆固醇流入及合成、增加流出，抑制巨噬细胞泡沫化，对冠心病病人极为重要[1]。脂肪酸转位酶(CD36)、酯酰辅酶A胆固醇酰基转移酶(ACAT1)是细胞内的胆固醇合成关键酶[2-4]。胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是结肠和小肠远端的L细胞分泌的胃肠激素，可刺激胰腺分泌胰岛素而发挥其降糖主要作用[5]。体内有两种生物活性形式，分别为GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)，7-36a为7-37的酰胺化产物。GLP-1约80%的生物活性来自7-36a[6]。目前研究在人体内的GLP-1具有抗动脉粥样硬化作用，但具体机制不详[7]，有证据显示体外重组GLP-1(rhGLP-1，7-36)与人体内活性GLP-1(7-36)结构及功能高度一致[8]。本研究分析GLP-1(7-36)是否可以降低巨噬细胞源性泡沫细胞CD36、ACAT1基因及蛋白表达，从而抑制细胞内胆固醇积累，减轻巨噬细胞泡沫化程度，最终抑制动脉粥样斑块的形成。

1 材料与方法

1.1 主要仪器、试剂和实验设备 主要试剂：巨噬细胞株(上海中科院细胞中心)；GLP-1(7-36)(货号：249125，上海吉尔生化有限公司生产)；Exendin(9-39)(货号：055285，上海吉尔生化有限公司生产)；HPR标记二抗(武汉博士德生物工程有限公司)；氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)(北京欣和佳源公司)；ACAT1一抗(武汉三鹰生物有限公司)；CD36一抗(上海拜力生物科技有限公司)； RNA提取试剂 TRIzol(索莱宝公司)。RNA逆转录试剂盒( 索莱宝公司)。主要仪器及设备：37 ℃细胞培养箱( 美国Thermo公司，型号3141)；PCR仪和酶标仪(美国 Bio-Rad公司)；超净工作台(上海思龙科学仪器公司，型号VFS-650)；相差倒置显微镜(日本Nikon公司，型号7650)；水平摇床(德国IKA公司，型号KS400i)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及模型建立 从液氮储存罐中取出巨噬细胞于培养瓶中，加入15%的DMEM/F12培养液，3～4 d更换1次培养液，适宜的温度下培养，待细胞生长至覆盖80%～95%培养瓶体时，选择含0.25%的胰蛋白酶进行消化，按照1∶2进行传代。传至3～5代时，选取生长状况好的用于本实验。将培养后生长状况好的3～5代巨噬细胞调整合适的浓度，加入50 mg/L ox-LDL诱导，在37 ℃细胞培养箱培养36 h，建立巨噬细胞源性泡沫细胞模型。

1.2.2 细胞实验分组 巨噬细胞组：未干预传至3～5代的泡沫细胞；泡沫细胞组：ox-LDL诱导3～5代的巨噬细胞；不同浓度(0 nmol/L、1.5 nmol/L、3.0 nmol/L、5.0 nmol/L、10.0 nmol/L)GLP-1(7-36)干预组：先用ox-LDL诱导3～5代的巨噬细胞，之后分别加入浓度为0 nmol/L、1.5 nmol/L、3.0 nmol/L、5.0 nmol/L、10.0 nmol/LGLP-1(7-36)；GLP-1(7-36)+Exendin(9-39)组：先用ox-LDL诱导3～5代的巨噬细胞，后同时加入浓度为5.0 nmol/L GLP-1(7-36)和浓度为50.0 nmol/L的GLP-1(7-36)抑制剂，即Exendin(9-39)。

1.2.3 用RT-PCR分析各组细胞中的CD36、ACAT1 mRNA表达情况 首先等待细胞干预后，分离培养液，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗细胞2次或3次，用RNA提取试剂提取RNA，进行逆转录成cDNA及进行PCR扩增。逆转录过程引物选择，CD36上游引物序列为：5′-CTTTGAAAGAACTCTTGTGGGG -3′，下游引物序列为：5′-GTCTGTGCCATTAATCATGTCG -3′。ACAT1上游引物序列为：5′-ACGTAATGAGCAGAGGAGCAACAC -3′，下游引物序列为：5′-CGTATCCTGTTCCTGCCGTGAG-3′。β-Actin上游引物序列为：5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3，下游引物序列为：5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′。PCR扩增反应保证在95 ℃预变性30 s循环40次，60 ℃退火30～50 s，并且循环40次。RT-PCR反应结果获得Ct值。用2-△△Ct进行分析mRNA的表达。△△Ct=(CtCD36或ACAT1-Ctβ-actin)处理组-(Ct实验组-Ctβ-actin)未处理。

1.2.4 用Western Blot法分析各组细胞中的CD36、ACAT1蛋白表达水平 用PBS冲洗各实验组2次或3次，然后加入适当的蛋白裂解液0 ℃环境下静置30 min，再将上述液体置入新的EP管，在4 ℃离心机12 000 r/min 离心15 min，将上清液置入另一新EP管(即各组收集的蛋白)在-80 ℃环境下保存备用。用BCA蛋白定量法测定蛋白浓度，行十二烷基酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜，用含 5%牛奶 TBST 封闭 1 h，后孵育一抗(1∶1 000)，在 4 ℃环境下摇床过夜，TBST洗膜3次，每次5 min，二抗(1∶2 000) 室温摇床孵育2 h，凝胶成像分析系统中采集图像，测定条带灰度值。

2 结 果

2.1 各组细胞ACAT1、CD36mRNA的表达 与巨噬细胞组相比，泡沫细胞组ACAT1、CD36mRNA表达水平较高(P<0.05)；与泡沫细胞组相比，GLP-1组ACAT1、CD36mRNA表达水平明显降低(P<0.05)；与GLP-1组相比，GLP-1+Exendin组ACAT1、CD36mRNA表达水平较高(P<0.05)。详见图1。

与巨噬细胞组比较，＊P<0.05；与泡沫细胞组比较，#P<0.05；与GLP-1组比较，△P<0.05。

2.2 各组ACAT1、CD36蛋白的表达 与巨噬细胞组相比，泡沫细胞组ACAT1、CD36蛋白表达水平较高(P<0.05)；与泡沫细胞组相比，GLP-1组ACAT1、CD36蛋白表达水平明显降低(P<0.05)；与GLP-1组相比，GLP-1+Exendin组ACAT1、CD36蛋白表达水平较高(P<0.05)。详见图2。

2.3 GLP-1(7-36)干预组ACAT1、CD36mRNA的表达 不同浓度(0 nmol/L、1.5 nmol/L、3.0 nmol/L、5.0 nmol/L、10.0 nmol/L)GLP-1(7-36)组CD36、ACAT1 mRNA表达低于泡沫细胞组，但只有GLP-1(7-36)5.0 nmol/L干预组与0 nmol/L组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。详见图3。

2.4 GLP-1(7-36)干预组ACAT1、CD36蛋白的表达 不同浓度(0 nmol/L、1.5 nmol/L、3.0 nmol/L、5.0 nmol/L、10.0 nmol/L)GLP-1(7-36)组CD36、ACAT1蛋白表达低于泡沫细胞组，但只有GLP-1(7-36)5 nmol/L干预组与0 nmol/L组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。详见图4。

与巨噬细胞组比较，＊P<0.05；与泡沫细胞组比较，#P<0.05；与GLP-1组比较，△P<0.05。

与0 nmol/L组比较，＊P<0.05。

3 讨 论

巨噬细胞吞噬内皮下氧化的低密度脂蛋白胆固醇形成泡沫细胞，随着泡沫细胞增多、融合，逐渐形成动脉粥样硬化斑块的脂质核心[1]。CD36作为一个脂肪酸转移酶，是一种多功能跨膜糖蛋白，可以与游离脂肪酸结合，并促使他们进入细胞内，此功能是脂质在脂肪细胞内蓄积的基础介导细胞对ox-LDL的摄取，诱导单核巨噬细胞转化为泡沫细胞[9]。另有研究证明细胞内一部分游离胆固醇被运输至质膜，而另一部分多余的游离胆固醇被运输到内质网，在此处，由ACAT1进行催化，游离胆固醇酯化生成胆固醇酯，并以脂滴的形式储存在细胞内[10]。近年来研究表明上调CD36、ACAT1蛋白的表达，可以增加胆固醇摄取，脂滴在细胞内积聚，从而使得巨噬细胞泡沫化，形成泡沫细胞[11]。因此，研究减少巨噬细胞源性泡沫细胞内CD36、ACAT1蛋白的表达，可有效抑制巨噬细胞泡沫化。

目前研究证明GLP-1(7-36)激动剂可以改善超重成年人冠状动脉微循环障碍(CMD)，GLP-1使得小冠状动脉增加血管舒张剂储备以应对氧需求量增加的能力，从而减轻冠状动脉微循环障碍后引起的动脉粥样硬化[12]。另有研究证明早期、低负荷动脉粥样硬化病变的ApoE-/-小鼠，GLP-1(7-36)激动剂通过部分依赖性途径，抑制血小板的活化及稳定血小板，进而抑制早期、低负荷动脉粥样硬化病变的进展[13]。而本实验研究结果显示，不同浓度GLP-1(7-36)干预组中CD36、ACAT1的mRNA及蛋白表达均低于泡沫细胞组表达，并且表达在一定范围内(浓度<5.0 nmol/L)与GLP-1(7-36)激动剂浓度呈负相关。实验证明GLP-1(7-36)一定程度上可以减少细胞内胆固醇摄取、积聚过程的关键酶CD36、ACAT1的表达，从而抑制巨噬细胞泡沫化，减少脂纹、脂斑形成的成分，抑制动脉粥样化进展。随着对GLP-1的深入研究，很多实验均证实了GLP-1在心血管领域的获益，但现阶段却很少有研究涉及GLP-1能否通过影响巨噬细胞源性泡沫细胞内CD36、ACAT1基因及蛋白的表达从而抑制动脉粥样硬化。近年来，他汀类药物一直作为降脂首选药物，尽管新型他汀类药物已经问世，但也仍存在诱发肝损害和肌病的风险，因此，GLP-1类似物能否联合他汀抑制胆固醇合成，以减少他汀类药物的剂量，减少肝损伤及肌病发生，提供了新的降脂治疗研究方向。

不同浓度GLP-1(7-36)激动剂均能抑制胆固醇摄取、积聚关键酶的CD36、ACAT1基因及蛋白的表达，从而减少巨噬细胞泡沫化。尤其当GLP-1(7-36)激动剂浓度为5.0 nmol/L时，这种抑制效果最为显著。本实验研究结果显示，GLP-1(7-36)能通过抑制CD36、ACAT1基因及蛋白的表达，延缓动脉粥样硬化，但尚不能确定是否可以通过其他通路实现这一过程，尚需进一步研究。