王放，曹方引，刘园，张弛，郭俊，陈重华

四川大学华西药学院，成都610041

静脉补钾是临床治疗低钾血症的有效方法之一[1]，但静脉补钾易导致输注部位疼痛，甚至发生静脉炎，给患者带来治疗痛苦，极大影响患者的依从性。因此，寻找较少或较轻引起患者疼痛的补钾方法具有重要临床意义。0.3%氯化钾氯化钠注射液简称NK注射液，是我国参考美国及欧盟药典标准研制的一种成品氯化钾氯化钠注射液。动物实验显示[2]，以临床最大输注速度和剂量给予家兔耳缘静脉输注NK注射液，家兔无疼痛行为反应，对输注血管局部刺激性的组织学观察与生理盐水相同。钾离子是一种致痛因子，注入体内能引起疼痛反应[3]。2018年4～8月，我们采用同步给予实验小鼠腹腔及足底皮下注射NK注射液、临用前配制氯化钾氯化钠注射液(简称PK注射液，与NK药物氯化钾含量相同)致痛，比较动物出现扭体、抖足、抬足、跛行等可测量疼痛反应行为的差异，间接验证NK注射液致痛作用较少或较轻；同时检测疼痛传导神经通路上脊髓背角的P物质(SP)、NK-1受体(NK1R)、谷氨酸(Glu)及脑组织SP、Glu的表达，以从多方面分析不同氯化钾氯化钠注射液致痛差异的原因。

1 材料与方法

1.1 主要材料 动物：SPF级雄性昆明鼠，体质量(20±2)g，购于成都达硕实验动物有限公司[SCXK(川)2015-030]，常规饲养于华西药学院IVC实验动物房[SYXK(川)2018-113]。药物与试剂：NK注射液(商品名美佳莱)为四川奇力制药产品，规格250 mL，含氯化钾0.75 g、氯化钠2.25 g，批号180317；PK注射液：10 mL注射器取9.7 mL 0.9%氯化钠注射液(四川科伦药业股份有限公司)于EP管(10 mL)，1 mL注射器取10%氯化钾注射液(湖北科伦药业有限公司)0.3 mL加入EP管，即刻取药液用于足底皮下或腹腔注射。兔抗SP、NK1R、Glu多克隆抗体，购于武汉博士德生物有限公司；GTVisionTMⅢ型免疫组化检测试剂盒(含DAB)购于基因科技(上海)股份有限公司；SP、Glu ELISA试剂盒购于武汉基因美有限公司。主要仪器：BX53F型光学显微镜及图像采集系统(日本Olympus公司)；iMark酶标仪(日本BIO-RAD公司)；台式高速冷冻离心机(TGL-16M，上海卢湘仪公司)；电子天平(BSM 220.4，上海卓精公司)。

1.2 致痛作用观察方法

1.2.1 腹腔注射法(扭体法) 取SPF级雄性昆明鼠30只，随机均分为对照组、NK组及PK组各10只，分别给予腹腔注射生理盐水注射液(NS注射液)、NK注射液、PK注射液0.1 mL/10 g；注射完毕即开始观察小鼠反应，并在小鼠扭体反应出现频率最高，反应最剧烈时麻醉取材，记录15 min内出现扭体的动物数[3]。

1.2.2 足底皮下注射法 动物、分组同1.2.1，分别在小鼠右足足底皮下注射NS注射液、NK注射液、PK注射液30 μL/只；注射完毕即开始观察3 min内小鼠的行为反应，并记录得分情况，计算疼痛评分[3]。疼痛评分=Σ各行为得分×各行为持续时间(s)/180 s。

1.3 致痛机制分析方法

1.3.1 脑组织中SP、Glu检测 采用ELISA法。1.2.1实验观察完毕后，即以4%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠；切下头颅，迅速冰上开颅，剥取脑组织；分离出下丘脑和剩余脑组织，称重，液氮冷冻后-80 ℃冰箱保存。取下丘脑组织，加入一定量的PBS(pH 7.4)，冰浴中充分匀浆；2 500 r/min离心20 min，收集上清。ELISA法测定下丘脑中的SP、Glu含量，具体操作按试剂盒说明书进行。

1.3.2 脊髓背角组织中SP、NK1R、Glu检测 采用免疫组化法。1.2.2实验观察完毕后，即以4%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉动物。开胸，将灌注针自心尖插入左心室,并送至主动脉内；剪开右心耳，以生理盐水灌注冲洗至流出液澄清，用含4%多聚甲醛的0.01 mol/L的PBS灌注固定；取出脊髓腰膨大段(L4～L6)，以4%多聚甲醛液固定48 h，石蜡包埋。将蜡块沿脊髓行冠状连续切片(厚4 μm)，两步法分别进行免疫组化染色，操作步骤参照试剂盒说明书，用PBS代替一抗进行免疫组化阴性对照实验。每只小鼠分别取抗SP、NK1R、Glu免疫组化染色切片各3张，显微镜下黄色/棕黄色/褐色表达于胞质为阳性表达。采用Olympus图像采集系统，IPP 6.0图像分析软件于10×20倍测定脊髓背角浅层(Ⅰ、Ⅱ板层，Rexed 分层法)SP、NK1R、Glu免疫反应阳性的平均光密度值(AOD)。

2 结果

2.1 各组扭体行为比较 PK组出现扭体反应6只(60%)，NK组和对照组均未出现；PK组扭体反应发生率高于对照组和NK组(P均<0.05)，对照组和NK组差异无统计学意义。

2.2 各组疼痛评分比较 PK组疼痛评分(0.88 ± 1.15)分，NK组和对照组均为0分；PK组疼痛评分高于对照组和NK组(P均<0.05)，对照组和NK组差异无统计学意义。

2.3 各组脊髓背角组织中SP、NK1R、Glu表达情况比较 PK组脊髓背角组织中SP、NK1R、Glu表达量高于对照组和NK组(P均<0.05)，对照组和NK组差异无统计学意义。见表1。

表1 各组脊髓背角组织中SP、NK1R、Glu表达情况比较

2.4 各组下丘脑组织中SP、Glu含量比较 PK组下丘脑组织中SP、Glu含量高于对照组和NK组(P均<0.05)，对照组和NK组差异无统计学意义。见表2。

表2 各组下丘脑组织中SP、Glu含量比较

3 讨论

临床经常遇到急救、患者过多或其他不可预估因素等情况，需过急配制立即补钾。本实验模拟此类状况临用前配制氯化钾氯化钠注射液即PK注射液，并即刻取用。

钾离子是一种致痛因子，输液时可作用于血管神经末梢感受器，引起疼痛感，局部浓度越高疼痛感越强。临床用氯化钠注射液稀释氯化钾降低钾离子浓度以减轻钾离子所致的疼痛反应，其原因为钠离子进入细胞并激活Na+-K+-ATP酶，使神经元超极化，抑制后续兴奋的发生，从而减少疼痛的产生[4]。NK注射液是四川奇力制药有限公司参考美国及欧盟药典标准研制出的供静脉注射专利产品，采用原子吸收光谱技术严格控制成品钾及钠离子的浓度配比的成品。 本实验疼痛行为学结果显示，NK注射液较PK注射液能明显减少或减轻药物引起的动物疼痛反应。其机制或与以下因素有关：①NK注射液采用专利工艺处理，其生产过程中过滤、溶液配制、温度控制等均采用高精度设备，使成品溶液中离子浓度更精准；渗透压、pH值等溶液属性也严格符合国家药典标准，处于适宜范围。②临用前过急配制应用的PK注射液，存在局部钾离子未完全达到均一的可能，从而增加钾离子刺激所致疼痛；而NK注射液经过标准化生产过程，溶液均一稳定，钠钾离子分布更均匀。

SP是前速激肽原A基因编码的十一氨基酸多肽，属速激肽家族[5]。SP广泛分布于中枢和外周神经系统。在外周神经系统中，SP主要表达在伤害性感觉神经元上，参与外周伤害性刺激信息向脊髓背角的传递[6]。SP的生物学功能是通过结合SP受体实现的，SP受体又称速激肽受体(NKRs)，包括NK1R、NK2R、NK3R，均属于G蛋白偶联受体[7]。其中，SP作为天然配体与NK1R的亲和力最高[8]。NK1R在脊髓的每一层都有表达，在脊髓背角Ⅰ层含量最高[9]。当受到伤害性刺激时，SP一方面通过背根节神经元的周围突向外周释放，引起神经炎；另一方面，SP沿背根节神经元的中枢突运输至中枢[10]，主要存在于脊髓背角Ⅰ、Ⅱ层。下丘脑是调节内脏活动和内分泌活动的高级中枢所在，也是SP的主要分布部位。Glu是中枢神经系统最主要的兴奋性神经递质，兴奋性氨基酸能神经元及突触在中枢神经系统分布广泛，但主要集中于海马、大脑皮质浅层和脊髓的胶状质，对痛信号传导至关重要[11]。脊髓背角内由后根初级传入纤维形成的突触绝大多数是Glu能的，其可引起背角神经元兴奋，是一种对伤害性感受传递和敏化的关键递质[12]。已有许多研究报道认为，Glu、SP、NK1R含量或表达升高与疼痛或痛敏的发生有关[13～18]。本研究显示，NK注射液疼痛信息传递物质SP、NK1及Glu较PK注射液表达减少，这或许是实验中NK注射液较PK注射液所致疼痛减少、减弱的机制。

临床常需静脉补钾，NK注射液较PK注射液有以下优势：从用药操作方面，NK注射液无需配制，节省时间及人工成本；从用药安全方面，NK注射液可避免因配制可能出现的错配或离子配比、渗透压、pH值等改变超出质量要求范围等；从药物经济学方面，NK注射液与PK注射液费用基本相同。随着人们对医疗质量要求的逐渐提高以及经济的发展，NK注射液替代PK注射液的补钾方式应会是趋势。