刘晶晶，刘海娟，王荣

1 西安市第四医院，西安710075；2 西安交通大学基础医学院

子宫内膜癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，临床治疗有手术、放疗、化疗或激素等方法，但仍有15%～20%的患者出现转移[1]，然而转移灶的治疗手段有限导致患者预后极差[2]。因此，阐明与转移级联相关的信号通路是开发新的有效治疗方法的关键目标。Wnt3a作为Wnt家族最具代表性的信号蛋白，是经典Wnt信号通路的主要配体，其分布广泛。研究发现，Wnt3a在肿瘤发生和转移中起着复杂的作用。例如：Wnt3a生长因子诱导雄激素受体介导的转录并促进前列腺癌细胞生长[3]，CSF-1R通过Wnt3a信号促进非小细胞肺癌细胞的转移[4]，miR-214靶向Wnt3a抑制肝癌细胞增殖[5]，MiR-195靶向Wnt3a抑制结肠癌的增殖和转移[6]，Glypican-5通过与Wnt3a竞争性结合抑制肺腺癌的上皮-间质转化[7]，但Wnt3a在子宫内膜癌中的作用和机制尚不清楚。Dishevelled-2(Dvl-2)蛋白是Wnt信号通路中关键的信号蛋白分子，而PI3K-Akt-GSK3β通路在Wnt信号传导中起着重要而复杂的作用。2019年3～11月，我们观察了Wnt3a对子宫内膜癌细胞转移的影响，并探讨其是否通过Dvl-2激活PI3K-Akt-GSK3β通路起作用，为进一步阐明其在子宫内膜癌中发挥的调控作用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料 人子宫内膜癌细胞Ishikawa购自上海生物细胞研究所。DMEM培养基为北京索莱宝科技有限公司产品，超敏ECL化学发光试剂盒为ZATA公司产品，TurboFect 转染试剂为中国赛默飞世尔科技公司产品，PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)、PrimeSTAR Max DNA Polymerase cDNA Synthesis Kit均购于大连Takara公司；预染蛋白Marker为北京康为世纪生物科技有限公司产品，山羊抗兔IgG(H+L)-HRP、山羊抗鼠IgG(H+L)-HRP购自杭州联科生物技术股份有限公司，兔源GAPDH抗体为北京博奥森生物技术有限公司产品；PI3K抑制剂LY294002、Akt抑制剂CCT128930、GSK3β抑制剂AR-A014418购自美国Selleck生物科技公司；PI3K-Akt信号通路激活剂IGF-1购自购自上海碧云天生物有限公司；PI3-kinase p110γ抗体购自上海圣克鲁斯生物公司，p-AKT、GSK3β、Dvl-2抗体购自英国Abcam公司，siRNA NC、Dvl-2 siRNA质粒由北京擎科生物有限公司合成。

1.2. 细胞培养 将Ishikawa细胞接种于含10% FBS的DMEM培养基，于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养；待细胞长满后，按相应数量分别接种于培养皿或培养板中。

1.3 Wnt3a影响细胞活性观察 采用MTT法检测细胞活力。将Ishikawa细胞以1×105/mL接种96孔板，细胞融合度达70%～80%时，分别加入0、100、200、400、500 ng/mL Wnt3a，每浓度设5个复孔，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养48 h；用PBS洗3次，每孔加50 μL MTT，继续培养4 h；去上清，每孔加150 μL DMSO，低速振荡10 min，在酶标仪上读取各孔在570 nm处的吸光值。结果显示，Wnt3a<500 ng/mL时对细胞生长活性没有影响，而500 ng/mL时细胞生长活性显著降低，因此选用400 ng/mL以内的Wnt3a用于迁移实验。

1.4 Wnt3a影响细胞迁移能力观察 采用细胞划痕实验。待细胞融合度达95%时制成单细胞悬液，以3×105/孔接种于6孔板；显微镜下观察细胞贴壁后，用100 μL枪头垂直于孔板行细胞线性划痕，PBS洗去细胞碎片；加入无血清培养基或含50、100、200、400 ng/mL Wnt3a的DMEM培养基，分别于划痕即刻(0 h)、划痕后48 h用显微镜观察并拍摄细胞划痕照片，用Image J分别计算0 h、48 h的细胞迁移距离。细胞迁移距离=0 h的细胞划痕距离-48 h的细胞划痕距离。

1.5 Wnt3a影响Dvl-2、PI3K-Akt-GSK3β通路活性观察 将Ishikawa细胞以1×105/mL接种6孔板，细胞融合度达70%～80%时加400 ng/mL Wnt3a，分别于处理0、12、24、48 h收取细胞；采用Western blotting法检测Dvl-2、PI3K-Akt-GSK3β通路活性，按试剂盒说明书操作。以GAPDH为内参，以磷酸化目标蛋白与目标蛋白比值表示其活性。

1.6 Dvl-2在Wnt3a影响细胞迁移能力中的作用观察 将细胞以1×105/孔接种12孔板，细胞融合度达75%时分为对照组和阻断组，分别用Tubfect转染试剂转染siRNA NC、Dvl-2 siRNA质粒；转染48 h后收集各细胞，采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测Dvl-2基因。引物序列：Dvl-2上游为5′-GUGAGAGCUACCUAGUCAATT-3′，下游为5′-CGCUAAACAUGGAGAAGUATT-3′；内参GAPDH上游为5′-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3′，下游为5′- CGCUUCACGAAUUUGCGUGUCAU-3′。反应条件：95 ℃反应15 min；95 ℃作用15 s，60 ℃反应1 min，45个循环。融解曲线 55～95 ℃，每分钟升高0.5 ℃，采用2-ΔΔCt法分析定量结果。结果显示，阻断组Dvl-2基因表达量为0.45±0.27，低于对照组的1.08±0.64(P<0.05)，提示转染成功。将转染Dvl-2 siRNA的细胞分为阻断处理组和阻断对照组，转染siRNA NC的细胞分为对照处理组和对照组，均分别加或不加400 ng/mL Wnt3a处理48 h，按1.4的方法观察细胞迁移能力。

1.7 细胞中Wnt3a与Dvl-2、PI3K-Akt-GSK3β通路的调控关系分析 ①取转染siRNA NC、Dvl-2 siRNA质粒的Ishikawa细胞，分组处理同1.6，采用Western blotting法检测PI3K活性，方法同1.5。②取未处理的Ishikawa细胞，细胞分组与处理同1.6，仅阻断处理组和阻断对照组均预先加PI3K抑制剂LY294002(25 μmol/L)处理1 h；采用Western blotting法检测Akt活性，方法同1.5。③取未处理的Ishikawa细胞，阻断处理组和阻断对照组均预先加Akt抑制剂CCT128930(50 μmol/L)处理1 h,其后处理方法同1.6；采用Western blotting法检测GSK3β活性，方法同1.5。

1.8 PI3K-Akt-GSK3β通路在Wnt3a影响细胞迁移能力中的作用观察 将未处理的Ishikawa细胞以1×105/孔接种12孔板，细胞融合度达75%时分为4组；对照组不处理，PI3K阻断组、Akt阻断组、GSK3β阻断组分别先予以PI3K抑制剂LY294002(25 μmol/L)、Akt抑制剂CCT128930(50 μmol/L)、GSK3β抑制剂AR-A014418(25 μmol/L)处理1 h；然后4组分为两份分别加或不加400 ng/mL Wnt3a处理48 h，按1.4的方法观察细胞迁移能力。

1.9 Dvl-2调控PI3K-Akt-GSK3β通路在Wnt3a影响细胞迁移能力中的作用观察 将未处理的对数生长期Ishikawa细胞以1×105/孔接种12孔板，细胞融合度达75%时分为7组；对照组不处理，Wnt3a组加400 ng/mL Wnt3a处理，Dvl-2阻断组转染Dvl-2 siRNA质粒，通路激活组加PI3K-Akt信号通路激活剂IGF-1(100 ng/mL)，Dvl-2阻断+通路激活组先转染Dvl-2 siRNA质粒后加IGF-1(100 ng/mL)，Wnt3a+通路激活组同时加400 ng/mL Wnt3a、IGF-1(100 ng/mL)，Dvl-2阻断+ Wnt3a+通路激活组先转染Dvl-2 siRNA质粒后加400 ng/mL Wnt3a、IGF-1(100 ng/mL)；处理48 h后，按1.4的方法观察细胞迁移能力。

假定机身处于水平或近水平状态，只存在偏航和横向偏移，事实上，对于掘进机来说通过控制铲板和后支撑做到机身基本水平是容易的，在组合式导航系统中，惯性导航系统可以实时检测机身的横滚角和俯仰角，用于判断掘进机是否水平。解算模型如图2所示，设MN为机身纵向轴线，A、B、C、D分别表示其上表面4个特征点，A、B关于MN对称，C、D关于MN对称。

2 结果

2.1 Wnt3a对细胞迁移的影响 用50、100、200、400 ng/mL Wnt3a处理后细胞迁移距离分为(4.25±0.72)、(5.82±0.73)、(6.39±0.91)、(8.92±0.35)mm，均大于未经处理(0 ng/mL Wnt3a)细胞的(3.05±0.28)mm(P均<0.01)，细胞的迁移能力随Wnt3a浓度升高而升高。

2.2 Wnt3a对细胞中Dvl-2、PI3K-Akt-GSK3β通路活性影响 400 ng/mL Wnt3a处理细胞后，随着作用时间的延长，Dvl-2、PI3K-Akt-GSK3β通路活性均逐渐增高，Dvl-2活性24 h最高，PI3K-Akt-GSK3β通路活性48 h最高。见表1。

表1 400 ng/mL Wnt3a处理不同时点细胞中Dvl-2、PI3K-Akt-GSK3β通路活性变化

2.3 Dvl-2在Wnt3a影响细胞迁移能力中的作用 对照处理组细胞迁移距离为(8.92±0.35)mm，大于对照组的(3.05±0.28)mm(P<0.01)；阻断对照组细胞迁移距离为(2.06±0.57)mm，小于对照组(P<0.05)；阻断处理组细胞迁移距离为(3.18±0.72)mm，小于对照处理组(P<0.01)。

2.4 Wnt3a通过Dvl-2激活PI3K-Akt-GSK3β信号通路 ①细胞中Wnt3a与Dvl-2、PI3K的调控关系：干扰Dvl-2表达，细胞中PI3K活性(p-PI3K/PI3K)对照组处理组(1.52±0.26)>对照组(0.97±0.58)>阻断对照组(0.23±0.12)、阻断处理组(0.27±0.38)，P均<0.01。②细胞中Wnt3a与PI3K、Akt的调控关系：干扰PI3K表达，细胞中Akt活性(p-Akt/Akt)对照处理组(1.32±0.72)>对照组(0.45±0.39)>阻断对照组(0.21±0.26)、阻断处理组(0.23±0.14)，P均<0.01。③细胞中Wnt3a与Akt、GSK3β的调控关系：干扰Akt表达，细胞中GSK3β活性(p-GSK3β/GSK3β)对照处理组(1.49±0.37)>对照组(0.87±0.56)>阻断对照组(0.21±0.36)、阻断处理组(0.17±0.18)，P均<0.01。

2.5 PI3K-Akt-GSK3β通路在Wnt3a影响细胞迁移能力中的作用 细胞迁移距离未加Wnt3a的PI3K阻断组、Akt阻断组、GSK3β阻断组<未加Wnt3a的对照组及加Wnt3a的PI3K阻断组、Akt阻断组、GSK3β阻断组<加Wnt3a的对照组，P均<0.05或<0.01。见表2。

表2 阻断PI3K-Akt-GSK3β通路对Wnt3a促进细胞迁移的影响

2.6 Dvl-2调控PI3K-Akt-GSK3β通路在Wnt3a影响细胞迁移能力中的作用 细胞迁移距离Wnt3a+通路激活组[(17.85±0.95)mm]>Wnt3a组[(8.92±0.35)mm]、通路激活组[(9.83±0.48)mm]>Dvl-2阻断+通路激活组[(6.03±0.72)mm]、Dvl-2阻断+Wnt3a+通路激活组[(6.72±0.91)mm]>对照组[(3.05±0.28)mm]>Dvl-2阻断组[(2.06±0.57)mm]，P均<0.05或<0.01。

3 讨论

肿瘤细胞易转移的特性是导致子宫内膜癌患者治疗后复发的关键，为了提高生存率，控制肿瘤的侵袭和转移是很重要的。转移是一个多步骤的过程，在此过程中，原发性肿瘤中的肿瘤细胞失去细胞之间的黏力，突破基底膜，增加侵袭性，使其循环灌注到远处的组织，从循环系统中渗出后在远处定植[8]。有研究表明，Wnt信号通路调节多种生物过程，包括细胞生长、发育、转移和癌变[9]。近年来，大量研究发现Wnt信号通路通过与肿瘤微环境或其他信号通路相互作用，参与肿瘤细胞侵袭和转移的调控[10]。Wnt3a是Wnt信号通路的重要组成部分，可以激活下游信号通路。有研究发现，Wnt3a对非小细胞肺癌细胞生长具有促进作用[11]，Wnt3a介导β-catenin/Wnt信号通路激活可促进胶质母细胞瘤的恶化，EBP50通过Wnt3a/β-catenin信号通路可抑制乳腺癌细胞侵袭和转移[12]。本研究发现，Wnt3a能够促进子宫内膜癌细胞的迁移，表明Wnt3a在子宫内膜癌发展过程中具有一定作用。

Dvl蛋白是Wnt信号通路中关键的具有高度保守区域的信号蛋白分子，目前发现其具有3种同型异构体,在人的脑、心、肺、肾、骨骼肌等组织中均有表达；并且已有多个研究报道，Dvl在乳腺癌、结肠癌、前列腺癌和肺癌等肿瘤组织中高表达。Dvl-2是该家族中的重要成员之一，定位于17号染色体短臂13区，在3种异构体中其表达量最高(约占80%)。有研究显示，特异性下调Dvl-2表达可显著抑制Wnt3a依赖性细胞的形态和运动改变，Wnt通过下调Dvl-2在非小细胞肺癌细胞中表达可抑制Wnt/β-catenin信号通路[13]。Dvl磷酸化是膜受体激活下游的最近端信号传导事件，我们研究发现Wnt3a在子宫内膜癌细胞中诱导Dvl-2磷酸化，通过siRNA转染阻断Dvl-2信号转导可阻断Wnt3a诱导的细胞迁移，提示Dvl-2的激活参与了子宫内膜癌迁移的调控。

研究表明，Wnt5a可能通过诱导肌动蛋白重组和激活蛋白激酶C(PKC)来促进肿瘤的进展[14]，或通过触发PI3K/Akt信号促进人皮肤成纤维细胞黏附[15]，或通过PI3K/Akt/GSK3β信号通路调控人卵巢癌SKOV3/VCR细胞对长春新碱的敏感性。Wnt3a通过激活IRS2/PI3K信号调节胰腺癌NIT-1β细胞增殖、凋亡及功能[16]，PI3K-Akt通路介导Wnt3a诱导的成骨细胞分化，Wnt3a和肝素通过激活PI3K/Akt/RUNX2通路协同增强成骨细胞中碱性磷酸酶(ALP)活性[17]。这些结果表明，PI3K/Akt在各种细胞和组织类型的Wnt信号传导中起着重要而复杂的作用。在本研究中，我们发现Wnt3a在子宫内膜癌细胞中能诱导PI3K、Akt磷酸化，化学抑制阻断PI3K和Akt阻碍了Wnt3a诱导的细胞迁移，表明PI3K/Akt活化参与了子宫内膜癌细胞迁移的调控。GSK3β可通过Akt介导的途径在Ser9位点磷酸化参与多种肿瘤的形成[18]。我们的实验结果表明，Wnt3a显著提高了子宫内膜癌细胞中GSK3β的磷酸化水平，抑制剂干扰GSK3β功能后明显抑制了子宫内膜癌细胞的迁移。此外，通过化学抑制Akt可显著降低Wnt3a诱导的GSK3β磷酸化，提示GSK3β作用于PI3K/Akt的下游；而且干扰Dvl-2表达后，Wnt3a诱导的PI3K磷酸化水平下降，表明Dvl-2是Wnt3a激活PI3K的介导者。

综上所述，Wnt3a能够通过Dvl-2激活PI3K-Akt-GSK3β信号通路，从而促进子宫内膜癌细胞的迁移；然而调控机制可能仅仅是一方面，有关Wnt3a、Dvl-2和PI3K-Akt-GSK3β通路之间的关系需要进一步研究，为改善子宫内膜癌患者的临床预后提供更多的理论依据。