郑雪莹，包博文，卢文卿，王一喆，刘云鹏，车晓芳

中国医科大学附属第一医院 辽宁省肿瘤药物与生物治疗重点实验室 辽宁省恶性肿瘤临床医学研究中心，沈阳110001

近年来，随着肿瘤规范化诊疗水平的巨大进步，早期胃癌患者的预后已得到显著改善，但我国晚期胃癌患者5年生存率仍很低，仅约为5%[1]。为准确预测患者预后、制定合理治疗方案，迫切需要建立有效的胃癌预后评估模型。然而，传统基于病理分期、分型等的胃癌预后模型准确性有限。因此，探索有效的分子标志物并构建预后模型具有重要意义。碘甲状腺素脱碘酶(DIO)家族是一类含硒蛋白酶，由DIO1、DIO2、DIO3构成，主要作用是催化甲状腺激素(TH)活化(DIO1、DIO2)或失活(DIO3)。众所周知，TH是关键细胞过程的重要调节剂，参与细胞增殖、分化、凋亡和代谢等，TH信号传导异常与肿瘤形成息息相关，而TH在外周组织中的表达通过DIO的活性来调节。因此，DIO家族在肿瘤发生发展中的作用已逐渐引起关注[2]。现有研究显示，DIO家族成员在多种肿瘤中高表达，在不同肿瘤中可能发挥着不同的作用[3～10]。最近一项数据分析表明，DIO家族成员是胃癌预后的危险因素[11]。然而，目前尚无利用大样本在线数据，通过生物信息学分析DIO家族在肿瘤预后中的作用及其可能机制。2019年11月～2020年6月，我们利用基因表达汇编(GEO)数据集，运用Cox回归分析筛选出DIO家族中影响胃癌患者生存的独立预后因素，由此计算出风险评分RS1，并利用基因集富集分析(GSEA)探索高RS1可能富集的通路，最终利用RS1和其他独立预后因素构建预后预测列线图。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 数据资料收集 在美国国家生物技术信息中心(NCBI)的GEO数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)中下载胃癌样本数据集GSE62254，选取其中临床病理学参数及生存资料完整的病例，最终得到283例。

1.2 DIO家族在胃癌预后中的价值评估 利用Cox单因素分析、多因素分析筛选出DIO家族中的胃癌独立预后因素，计算风险评分(RS)。RS1=β1×exp DIOX1+β2×exp DIOX2+…+βn×exp DIOXn，其中β表示偏回归系数，exp DIOXn表示DIOn基因表达量，计算每个样本的RS1。分别以基因表达量/RS1作为自变量、生存状态作为因变量绘制ROC曲线，计算约登指数及ROC曲线下面积(AUC)，选取约登指数最大时的最佳截断值。根据最佳截断值将样本进行二分类，低于该值的样本为低表达组，高于该值的样本为高表达组，然后采用Kaplan-Meier法进行生存分析。

1.3 DIO家族RS1在不同胃癌临床病理学参数患者中的比较 利用χ2检验及Fisher确切概率法比较RS1在胃癌患者不同性别、年龄、浸润深度(T分期)、淋巴结转移(N分期)、远端转移(M分期)及Lauren分型等临床病理学参数中的差异。

1.4 与高RS1可能相关的信号通路分析 采用GSEA3.0软件进行基因富集分析。按照上述方法将样本分为高RS1组和低RS1组，从GSEA网站MsigDB数据库中获得c2.cp.kegg.v6.2.symbols.gmt数据集，使用默认加权富集统计的方法进行分析，将随机组合次数设定为1 000次。

1.5 胃癌独立预后因素筛选及基于RS1的预后预测列线图建立 利用Cox单因素及多因素分析筛选出胃癌独立预后因素，并构建基于RS1的预后预测列线图，用于预测胃癌患者1年、3年及5年总生存率。通过每一变量分类对应小标尺上的数值得出每项的分值，并将它们相加得到总分值，总分值向下投射则得到该患者的1年、3年及5年生存率。

1.6 统计学方法 采用SPSS16.0软件进行统计学分析，使用Graphpad Prism 8.0进行生存曲线及ROC曲线绘制。回归分析采用Cox比例风险回归法，并对Cox单因素分析中预后影响因素进行多因素分析。生存分析采用Kaplan-Meier及Log-Rank检验法，相关性分析运用χ2检验和Fisher确切概率法。GSEA所得基因集以P<0.05且错误发现率(FDR)<0.25为显著富集基因集。采用R3.3软件中的RMS包(http://www.r-project.org/)进行列线图的构建。

2 结果

2.1 DIO家族在胃癌患者预后中的意义 单因素分析的结果显示DIO2和DIO3为影响胃癌患者预后的因素,多因素分析结果提示二者均为独立预后因素(表1)。按DIO2最佳截断值7.665(AUC=0.594,95%CI0.518～0.660，约登指数最大值0.164)、DIO3最佳截断值5.784(AUC=0.556,95%CI0.488～0.623，约登指数最大值0.168)分别将样本分为高、低表达两组，结果DIO2和DIO3高表达组患者总生存期(OS)分别为28.25、31.1个月，均短于低表达组的60.2、61.07个月(P均=0.002)。

2.2 DIO家族RS1在胃癌患者预后中的意义 按RS1最佳截断值4.87(AUC=0.623，95%CI0.558～0.688,约登指数最大值0.2)将样本分为高RS1组及低RS1组，高RS1组OS(30.95个月)短于低RS1组(77.2个月)患者(P<0.001)。见图1。

表1 胃癌患者关于DIO家族的单因素和多因素回归分析结果

注：A为ROC曲线；B为Kaplan-Meier生存曲线。

2.3 不同临床病理学参数胃癌患者RS1比较 M1期、Lauren分型弥漫型胃癌患者高RS1比例分别高于M0期及肠型、混合型(P均<0.05)，而不同性别、年龄、T分期、N分期胃癌患者RS1差异无统计学意义。见表2。

表2 不同临床病理学参数胃癌患者RS1比较[例(%)]

2.4 RS1的基因富集分析结果 GSEA分析结果显示，高RS1组富集到黏着斑(P<0.001, FDR=0.038)、钙信号通路(P<0.001,FDR=0.061)、缝隙连接(P<0.001, FDR=0.043)和细胞外基质(P=0.008,FDR=0.083)等转移相关通路，提示高RS1与这些通路密切相关。

2.5 胃癌独立预后因素筛选结果及基于RS1的胃癌预后预测模型 单因素分析显示，高RS1、浸润更深(T3～4)、淋巴结转移(N1)、远处转移(M1)及弥漫型是影响胃癌患者预后的危险因素；多因素分析结果显示，高RS1、浸润更深(T3～4)、淋巴结转移(N1)、远处转移(M1)是影响胃癌患者预后的独立危险因素(P均<0.01)。见表3。依据赤池信息量准则，将4个胃癌预后的独立危险因素纳入并构建了预后预测列线图模型。如图2所示，C-index=0.717(95%CI0.668～0.752)，采用Bootstrap内部检验1 000次，预测值与实际值的r2为0.246 1，说明此模型具备良好的拟合度。根据列线图，高RS1及T分期、N分期、M分期较晚的胃癌患者，其对应评分增加，生存率降低。

表3 胃癌患者基于RS1和临床病理学特征的单因素和多因素回归分析结果

图2 胃癌患者1年、3年及5年总体生存率预测列线图

3 讨论

在本研究中，我们利用GEO胃癌数据库中的GSE62254数据集分析了DIO家族在胃癌预后中的作用，发现DIO2、DIO3为影响胃癌预后的独立因素；计算基于DIO家族的胃癌预后风险评分RS1，并利用GSEA分析高RS1导致预后不良的可能相关信号通路；最后，构建了包含RS1和临床病理学参数的预后预测列线图模型。

DIO家族是催化TH活化或失活的一类脱碘酶。TH对于正常的身体发育和细胞分化至关重要，TH信号通过特定的TH受体(TR)和位于质膜的受体介导，TR以配体依赖性方式直接调节靶基因的表达。TR结合的配体是三碘甲腺氨酸(T3)，其主要成分通过从四碘甲丙氨酸(T4)中选择性脱碘而合成，这种脱碘过程则由DIO家族催化。其中，DIO1与DIO2通过T4的5′脱碘催化T3的合成，故为TH活化酶；而DIO3则通过5′脱碘导致T3的失活，因此催化TH的失活。脱碘酶对细胞内TH浓度起主要的代谢控制作用，从而调节组织特异性TH生物利用度[2,12]。近年来，越来越多的证据表明DIO家族在肿瘤中发挥着重要作用。在肾透明细胞癌及肺癌等肿瘤组织中DIO1活性下降，而在乳腺癌组织中DIO1活性增强[3]。因此，DIO1表达在癌组织中的整体作用仍然不够明确。Kojima等[6]研究发现，在原发性直肠肿瘤组织中DIO2表达较正常组织上调，并能促进肠道肿瘤细胞增殖；最终表明，肿瘤微环境中DIO2通过调节TH信号促进肠道肿瘤发展，揭示了DIO2作为治疗靶标的潜在意义。Mariani等[7]通过对卵巢癌原发肿瘤及其肠转移瘤进行RNA测序发现，DIO2在卵巢癌患者肠转移中过表达。DIO3在肿瘤中作用研究的最为广泛，因其在胚胎发育和癌症中高表达而被定义为“钉螺”蛋白。已有研究发现，DIO3在多种恶性肿瘤组织中高表达，且其表达水平与肿瘤大小、转移呈正相关[8,9]；在良性腺瘤和结肠癌中，DIO3表达高于正常组织，但与病变的组织学分级呈负相关，表明DIO3可能与结肠癌的发生关系密切[10]。但值得注意的是，Mishra等[11]利用“The Kaplan-Meier plotter”在线数据库进行数据分析的结果提示，DIO1、DIO2、DIO3 mRNA表达增加均与胃癌患者的OS缩短显著相关。然而，当分别对不同Lauren分型进行生存分析时发现，DIO1为肠型患者的预后危险因素，却未能对弥漫型患者的预后产生影响；而DIO2仅为弥漫型患者的预后危险因素；DIO3在肠型和弥漫型患者中均显示出高表达预后差的趋势。这与我们在利用Cox单因素和多因素分析DIO家族成员对胃癌预后影响的研究结果不完全一致，可能是由于二者数据来源不同及胃癌的高度异质性所致，今后我们还需采用更大的样本量、采用多种方法进行验证。

尽管已有研究证实，DIO家族成员可参与多种肿瘤的发展过程，但其具体作用机制尚不十分清楚。我们的结果提示，高RS1与远处转移显著相关，且GSEA富集分析揭示了高RS1可能通过调控黏着斑、钙信号通路、缝隙连接、细胞外基质等信号通路促进远处转移。肿瘤细胞转移是一个复杂的多步骤、多功能生物学事件，而这些级联事件中涉及了诸多分子及信号通路[12,13]。既往研究表明，黏着斑通路、钙信号通路、缝隙连接、细胞外基质通路均与肿瘤细胞的侵袭和转移密切相关[14]。这与本研究GSEA分析结果相一致，提示DIO家族可能通过影响胃癌细胞生物学行为促进远处转移，最终影响患者生存。

目前，在肿瘤的预后预测研究中，基于回归模型构建列线图已被广泛应用。不同于传统的病理学分期，列线图所呈现的简洁直观的数字界面使预后评估更高效准确，并且对临床决策的实施具有指导意义，有利于与患者的沟通。在胃癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、食管癌等多种肿瘤中，列线图均展示了其在预后预测方面的优势[15～19]。然而，目前列线图在胃癌中的研究大多数纳入的仅仅是临床病理学参数，或用于术后复发或转移部位的风险评估[20]。本研究首先利用COX回归计算出基于DIO家族的风险评分RS1，将包括病理学参数在内的影响胃癌预后的独立因素纳入至列线图的构建中，建立了基于DIO家族的胃癌预后预测列线图模型；并且，通过该模型可简单迅速地得到相应的1年、3年和5年生存率，极大提高了临床工作中个体化精准治疗的效率。

本研究以GEO胃癌数据库为基础进行数据分析，样本量较大且临床资料客观完整，并创新性地建立了基于DIO家族在胃癌中的预后预测模型，具有较强的说服力和临床意义。然而，本研究也存在一定的局限性。首先，GEO数据库是基于二代测序或高通量芯片的mRNA数据，可能无法完全真实地代表DIO各成员的蛋白表达水平；其次，数据库中缺乏肿瘤位置、驱动基因状态等影响胃癌预后的重要因素，并且缺乏内部和外部验证。因此，在下一步工作中，我们计划收集大样本的胃癌患者标本，利用实时荧光定量PCR和免疫组化检测DIO1、DIO2及DIO3的mRNA和蛋白表达情况，并利用细胞实验和动物实验对GSEA富集到的通路加以验证，深入探讨DIO家族在胃癌中的相关机制，同时对预后预测列线图模型加以补充和完善，以期该模型能够真正实现胃癌的精准预后预测，有效指导临床决策。