冯建华，贺丽华，赵海超，赵海香,2

(1.河北北方学院 理学院化学系,河北 张家口 075000；2.河北北方学院 应用化学研究所，河北 张家口 075000)

0 序 言

尿素是哺乳动物和某些鱼类体内蛋白质代谢分解的主要含氮终产物，通常用作植物的氮肥，适用于一切作物和所有土壤。在利益驱使下，不法商家将尿素用于豆芽生产中，从而提高产率，缩短生产周期、使豆芽粗壮，生产“速成豆芽”[1]，虽然在《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》(GB2760—2011)中已不包括尿素，但是尿素等违法添加剂泡制的“问题豆芽”不容忽视。近几年，工商、农业等部门对豆芽的抽查结果显示，含尿素等非食用成分的毒豆芽不断出现[2]，豆芽菜的食用安全引起大家的密切关注。在黄豆芽的生长过程中，大豆的成分会发生许多变化，使豆芽菜营养丰富，具有独特的风味，丰富人们的餐桌。L.L.McKINNEY[3]等研究表明，在豆芽生长的6 d时间里，大豆的总氮损失为2.6%，其中蛋白氮含量降低15%，非蛋白氮相应增加，主要是蛋白质水解为氨基酸和肽。黄豆芽生产过程中会发生蛋白氮到非蛋白氮的转化，对于尿素的光度法检测有一定的影响，易产生假阳性[4]。

尿素检测的方法主要为光度法，如二乙酰一肟安替比林法[5-8]、对二甲氨基苯甲醛法[9-11]、丁二酮单肟法[12]、亚硝酸钠-格里斯千试剂显色法[4]。豆芽中尿素的测定多采用光度法[2,4-6]，研究采用上述列举的光度法检测豆芽中的尿素，发现绿豆芽均能取得很好的显色效果，但是黄豆芽均显色不明显，空白样品易出现假阳性，添加样品显色亦不明显。对于复杂样品，分光光度法基质干扰大，常采用液相色谱法。尿素是一种强极性化合物，常采用亲水性色谱柱[13-14]，延长尿素的保留时间，采用高效液相色谱法(HPLC/UV)或液相色谱质谱法LC-MS[14-15]测定。反相C18色谱柱对尿素保留能力弱，保留时间较短，且易与杂峰重叠[16]，为了有效检测尿素，常采用9-羟基吨进行衍生化处理后，用荧光检测器检测，操作比较繁琐[16-20]。豆芽样品中残留物检测多采用酸性乙腈提取[21-24]，净化方法包括一维色谱[21]、QuEChERS(C18)[22-23]、分散液液微萃取(DLLME)[25]等。采用超高效液相色谱串联质谱UPLC/MS/MS检测可以有效去除基质干扰，降低灵敏度[22-25]。本研究采用多壁碳纳米管固相萃取(MWCNTs SPE)净化样品，可以消除杂质峰与尿素峰的重叠，建立了反相(HPLC/UV)测定黄豆芽和绿豆芽中尿素的方法，实现了对豆芽样品水提取液(豆浆状)的净化分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

尿素标准品(99.5%，100 mg，Chem Service)，乙腈、乙酸乙酯、甲醇和乙醇为色谱纯(美国ACS公司)，NaCI、Na2SO3、浓硫酸、磷酸、二乙酰一肟为分析纯(国药集团)。C18、活性炭、中性氧化铝、PSA(迪马科技)；多壁碳纳米管(L-MWCNT-2040)，购于深圳纳米港公司，使用前于120 ℃下烘干3 h，干燥器中冷却备用。

尿素[CO(NH2)2]标准储备溶液(1 g·L-1)：称取尿素100 mg，溶于少量水中，定容100 mL，混合均匀，4 ℃贮藏。

尿素标准工作液:移取标准储备液适量，用乙腈-水(5∶95，V/V)溶液稀释成适宜浓度的标准工作液，使用前配制。

酸性试剂：在烧杯中加入约300 mL水，然后加入浓硫酸44 mL及85%磷酸66 mL。冷却至室温后，再加入硫氨脲0.008 0 g、硫酸镉2.0 g，转移至1 L容量瓶中，溶解后用水稀释至1 000 mL。置于棕色瓶中，放入冰箱内可保存半年。

二乙酰一肟(C4H7NO2)试剂(2%)：称取二乙酰一肟2.000 0 g，溶于少量水中，稀释并定容至100 mL。置棕色瓶中放入置冰箱内可保存半年。

使用液(显色剂)：酸性试剂90 mL和2%二乙酰一肟10 mL，混合均匀，使用前配制。

1.2 仪器与设备

Waters e2695四元液相色谱仪，配2489UV/Vis检测器和Empower 3色谱工作站，色谱柱为Symmetry C18(4.6 mm i.d.×250 mm，5 μm)(美国Waters公司)；TU-1810紫外可见分光光度计，配1 cm石英比色皿，波长范围180～860 nm(北京谱析通用有限责任公司)；H1850R型台式高速冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；12孔固相萃取装置(美国Supelco公司)；MS3型涡动混合仪(德国IKA公司)。

1.3 方法

1.3.1 尿素的提取

称取豆芽样品2.00 g于50 mL离心管中，加入10 mL水，混合均匀，超声提取10 min，离心(10 000 rpm，RCF 10614)7 min，移取上清液于另一干净的离心管，再加入10 mL水提取一次，混合提取液，过MWCNTs SPE柱净化。

1.3.2 净化

称取MWCNTs 0.3 g与6 mL于空固相萃取柱管中，填装高度为0.8 cm。填装好的MWCNTs SPE柱用5 mL甲醇、5 mL水活化，控制流速为1 mL/min，移取提取液5 mL通过MWCNTs SPE柱，弃去MWCNTs SPE柱最初1 mL流出液，然后收集流出液2～3 mL，过0.22 μm滤膜，进行HPLC/UV测定。

1.3.3 HPLC/UV条件

实验采用梯度洗脱，流速0.4 mL/min，柱温35 ℃，检测器波长200 nm，进样量10 μL，运行时间10 min。流动相A为乙腈溶液，流动相B为水，流动相梯度洗脱程序：0～3.0 min，5%～10%A；3.0～3.5 min，10% A；3.5～6.0 min，10%～5% A；6.0～10.0 min，5% A。

1.3.4 二乙酰一肟分光光度法实验条件

准确移取提取液上清液0.1 mL，混合均匀，再分别向各管加入9.9 mL使用液，于沸水浴中反应15 min，立即用冷水冷却，在20 min内，以试剂空白(0.1 mL水中加入9.9 mL使用液，即尿素浓度为0.0的试管)为参比调零，于波长525 nm处测定吸光度，根据添加标准曲线，采用外标法进行定量分析。

2 结果与分析

2.1 提取方法的确立

依据参考文献，实验多种不同的提取溶剂。(1)乙醇[19]，(2)水[5-6]，(3)1%乙酸水溶液[20]，(4)乙酸乙酯，(5)乙腈[21-24]。实验发现，采用有机溶剂做提取溶剂，提取液较澄清，需要旋转蒸发等过程除去有机溶剂后，再用5 mL水溶解。采用水做提取溶剂，提取液浑浊(接近乳浊液)不容易处理，样品提取液不能采用HPLC/UV直接测定，高速离心(10 000 rpm)可获得较澄清提取液，易于进一步净化。为了考察不同提取剂的提取效率，提取液中尿素的含量采用二乙酰一肟分光光度法测定。对于添加尿素浓度为100 mg·L-1的2 g绿豆芽样品，进行平行5次测定，回收率如图1所示。

图1 绿豆芽不同提取剂的提取回收率(添加尿素100 mg·L-1，n=5)

由图1可知，有机溶剂做提取剂提取回收率较低，乙醇接近70%，乙酸乙酯和乙腈低于70%，水和1%乙酸水溶液提取回收率较高，接近90%，考虑到采用HPLC/UV法测定时，流动相为乙腈-水，选用水做提取剂。但是豆芽的水提取液近似于乳浊液，高速离心(12 000 rpm)也不能使溶液澄清，上清液也很难通过滤膜0.22 μm滤膜，因此不能直接进行HPLC/UV测定，必须经过净化除去脂类和蛋白等杂质。

2.2 净化方法的选择

主要研究固相萃取(SPE)和改进QuECHERS方法。SPE已经是一种很成熟的净化方法，对于样品中的痕量组分分析、富集非常有效，实验中采用了C18(500 mg/3 mL商品柱)、MWCNTs(300 mg/6 mL自填柱)、中性氧化铝(500 mg/6 mL自填柱)和活性炭(300 mg/6 mL自填柱)SPE柱对豆芽水提取液进行了净化效果比较，根据尿素的水溶性较大，考虑提取液通过SPE柱，尿素不被保留，杂质成分保留在柱上，所以接收SPE柱流出液。各个SPE柱经活化处理，取5 mL绿豆芽样品的水提取液上样，实验发现，C18和活性炭柱很快就被堵塞，5 mL绿豆芽样品的水提取液很难通过；氧化铝柱可以使提取液通过，但大约通过3 mL后，流出液变浑浊；MWCNTs柱可以使5 mL提取液全部通过而溶液透明，再用3 mL水淋洗，流出液依然透明。实验结果可知MWCNTs净化效果最好，获得透明溶液，可以进行色谱分析，对于C18、中性氧化铝和活性炭SPE柱，流出液不透明，不适于进行色谱分析。考虑到MWCNTs SPE柱活化是被水润湿，上样开始时，MWCNTs SPE柱所含水分对样品提取液有稀释作用，上样后期SPE柱存在过载趋势，所以对于2 g绿豆芽样品，采用20 mL水提取，取5 mL提取液进行净化时，对于0.3 g MWCNTs SPE柱，上样开始弃去最初的2 mL流出液后，收集流出液2 mL，过0.22 μm滤膜后，进行HPLC/UV测定。添加尿素浓度为100 mg·L-1时，重复测定5次，尿素的平均回收率为87.36%，测定的相对误差为4.3%，净化色谱见图2。

注：A：MWCNTs SPE柱；B：改进QuECHERS，流速1 mL/min。

改进QuECHERS方法操作简单。研究比较了4种改进QuECHERS净化方法。(1)在5 mL绿豆芽提取液中加入10 mg PSA和50 mgMWCNTs，涡混2 min，静置，离心(8000 rpm，RCF 6793)；(2)在5 mL绿豆芽提取液中加入2 mL CHCl3、10 mg PSA和50 mg MWCNTs，涡混2 min，静置，离心(8000 rpm，RCF 6793)；(3)在5 mL绿豆芽提取液中加入2 mL CHCl3和10 mg PSA，涡混2 min，静置，离心(8000 rpm，RCF 6793)，再取上清液过350 mg MWCNTs SPE柱；(4)5 mL绿豆芽提取液先通过250 mg MWCNTs SPE柱，弃去最初1～1.5 mL流出液，再收集1～1.5 mL流出液，通过中性氧化铝柱，弃去最初3～4滴流出液，收集0.5～1 mL流出液。收集液过0.22 μm滤膜后，进行HPLC/UV测定，经过对比发现，其中方法(2)净化效果最优，净化效果见图2，净化回收率比较见图3。

选取的MWCNTs SPE柱和改进的MWCNTs QuECHERS方法的净化回收率都都大于85%(100 mg·L-1)，都满足分析的要求。从图2的净化HPLV/UV色谱图可知，尿素与基质干扰的分离，SPE方法的净化效果较好。所以实验最终选择MWCNTs SPE柱的净化方式。

图3 QuECHERS净化方法对比(添加尿素100、400 mg·L-1，n=5)

2.3 HPLC/UV测定方法的选择和优化

尿素的测定，采用分光光度法可以获得较好的分析结果，实验中考察了3种分光光度法，分别为二乙酰一肟分光光度法、亚硝酸钠-格里斯千试剂显色法和二甲胺基苯甲醛法(DMAB法)。实验发现，对于绿豆芽样品，3种方法均能够准确测定，呈现正常的显色结果，即自制空白样品为阴性，添加样品和部分实际样品为阳性。但对黄豆芽样品，3种方法均出现假阳性，即自制空白样品为阳性，而且添加尿素量增加，溶液颜色不见明显加深，实验中通过改变试剂比例、用量等方法，以至于采用活性碳、碳纳米管、C18或中性氧化铝进行净化处理，也不能消除黄豆芽空白样品的假阳性，因此黄豆芽不适用分光光度法测定，为了更好的检出黄豆芽中的尿素，选用液相色谱法。

豆芽中尿素的测定，反相液相色谱法多采用有机溶剂(如乙醇)提取、柱后衍生荧光检测器测定[19]，操作繁琐；或采用极性色谱柱或者氨基柱分离基质中的尿素，以延长尿素的保留时间，使基质干扰峰与尿素峰分开；采用纯水为流动相的反相HPLC/UV报道较少。对C18色谱柱，采用5%有机相做流动相，有机相分别采用甲醇和乙腈，实验发现，乙腈与甲醇相比，色谱图较好。采用等度洗脱，5%乙腈-水为流动相，流速为1 mL/min，结果发现，尿素和基质色谱峰重合，不能实现有效分离。流速为0.5、0.4、0.3 mL/min时，均能实现尿素与基质的有效分离，低流速有利于尿素与基质的分离，但流速为0.3 mL/min时，色谱峰拖尾严重，适合的流速是0.4 mL/min。经过对不同梯度洗脱的优化，确定流动相A为乙腈，流动相B为水，梯度洗脱为：0.0～3.0 min，5%～10%A；3.0～3.5 min，10%A；3.5～6.0 min，10%～5%A；6.0-10.0 min，5%A。运行10 min，流速0.4 mL/min，实现了尿素色谱峰与基质干扰色谱峰的基线分离(图4)，尿素的保留时间为6.14 min。

注：A:尿素标准(1 mg·L-1)；B:黄豆芽空白样品；C:添加10 mg·kg-1的黄豆芽样品。

2.4 HPLC/UV测定结果

方法的线性范围为0.05～50 mg·L-1，标准曲线为y=2258x+1527，R2=0.999。根据S/N=10确定定量检出限为50 μg·L-1。对浓度为1 mg·L-1的尿素标准溶液连续进样10次，10次测定的相对标准偏差小于1.5%；对浓度为1 mg·L-1的尿素标准溶液在20日内，进样20次，20次测定的相对标准偏差小于3%。豆芽空白样品添加尿素进行测定，黄豆芽和绿豆芽中尿素的添加回收率见表1。方法的检出限为0.5 mg·kg-1。

表1 豆芽的添加回收率(n=6 kg-1)

2.5 实际样品测定

总计从市场和超市购买绿豆芽和黄豆芽样品各20份，其中普通豆芽样品15份(10份样品购于市场，5份购于超市)，绿色有机豆芽5份(购于超市)。根据所建立的HPLC/UV方法进行测定。结果绿色有机豆芽中未检出尿素；普通豆芽中，市场购买的样品检出率为50%，绿豆芽中含量为1.53～2.25 mg·kg-1，黄豆芽检出含量为1.53～2.43 mg·kg-1；超市购买的样品检出率为20%，含量为绿豆芽1.51 mg·kg-1、黄豆芽1.23 mg·kg-1。检测中发现，同一摊位的两种豆芽中尿素含量相近。

3 结论与讨论

建立了豆芽菜中尿素的HPLC/UV检测方法，考察多种提取、净化和测定方法，结果表明水对豆芽菜中尿素的提取回收率最高，MWCNTs SPE柱对水提取液的净化效果最好。分光光度法测定时黄豆芽样品易出现假阳性，且显色不明显，含有干扰测定的物质存在。采用HPLC/UV测定的报道较少，测定时采用低流速、梯度洗脱有利于基质与尿素的分离。实验中发现豆芽菜的水提取液为乳浊液(类似于豆浆)，离心等不能使其沉淀澄清，净化方法的开发十分重要，MWCNTs SPE柱虽能够使流出液变透明溶液，但是从净化色谱图(图4)可知，低浓度时基质可能干扰尿素的测定，所以HPLC/UV检测尿素的检测限较高。为了更加准确测定尿素含量，采用质谱法的SIM或MRM检测模式，可能会更好地消除基质的干扰。样品实际检测结果表明豆芽菜中存在使用尿素的现象。