李艳君，丁毅伟，赵强元，马 聪

解放军总医院第六医学中心 检验科，北京 100048

海洋细菌广泛分布于海洋环境中，可通过多种途径引发严重感染，如食用污染海产品引发的细菌性食物中毒、海水浸泡引发的伤口感染等[1-3]。从军事角度来看，战伤合并海水浸泡可能引起伤口细菌感染，给伤员救治带来一定难度，病原菌的快速鉴定对于感染的诊治至关重要。近年来基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS) 突破传统方法鉴定耗时长、鉴定能力不足等弊端，在临床得以广泛应用[4-7]。然而，在实际应用中我们发现，对于海洋细菌这一类特殊群体，MALDI-TOF MS 存在鉴定能力不足的问题，其主要的原因是仪器商品化的数据库包含的海洋细菌菌种资源较少，缺少可供鉴定比对的数据。本研究通过收集海洋环境来源细菌，建立本地化海洋细菌MALDI-TOF MS 鉴定数据库，目的在于提高海洋细菌的鉴定能力，从而为海洋细菌引起的各类感染性疾病的快速诊断和治疗提供帮助。

材料与方法

1 样本来源 本中心课题组选取2006 - 2016 年分离保存的国内外6 大海域158 个采样点海洋细菌530 株( 表1)，其中430 株用于构建数据库，100 株用于验证数据库鉴定能力。所有冻存菌株甘油保存液复温后以三区划线方式接种至哥伦比亚血琼脂培养基，35℃培养24 h，获得纯培养细菌菌落。

表1 用于自建库海洋细菌来源信息Tab. 1 Source information of marine bacteria for in-house database construction

2 仪器与试剂 德国Bruker 公司的Microflex 系列MALDI-TOF 质谱仪及配套分析软件FlexControl 3.4、Biotyper 3.1 和Flexanalysis3.1 ；美国ABI 梯度PCR 仪；质谱仪配套甲酸及基质液；Sigma 公司细菌DNA 提取试剂盒、PCR 反应试剂，法国梅里埃哥伦比亚血琼脂培养基。

3 基于16srDNA 测序的菌种鉴定 纯培养菌落用商品化试剂盒提取全基因组DNA，16srDNA 扩增通用引物序列为27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3'和1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，反应体系为30 μl(DNA 模板1μl，上下游引物各3μl，Buffer 3μl，dNTP 2μl，Taq 酶0.2μl，水17.8μl) ；扩增条件为95℃ 5 min，(95℃ 30 s，56℃ 40 s，72℃ 1 min)×30 循环，72℃ 10 min。扩增产物上机测序，序列结果登录国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI) 网站进行比对，明确菌种。

4 蛋白谱图的采集 纯培养菌落应用甲酸萃取法提取蛋白，吸取1μl 上清，滴加到MALDI 靶板上，每株菌制备到8 个靶位，晾干后滴加HCCA 基质溶液，干燥后上机检测。打开FlexControl 3.4 软件采集谱峰：每个靶位采图3 张，每张图轰击100次激光，将获得的24 张图谱在Flexanalysis 3.1 中打开，除去低质量的图谱。将＞20 张的有效图谱在Biotyper 3.1 中打开，( 若＜20 张则重复试验)，按照16srDNA 测序鉴定结果输入菌株名称，指定路径和目录完成建库过程。

5 数据库的验证 以16srDNA 测序鉴定结果为金标准，待鉴定海洋细菌分别用商品化数据库、自建数据库和扩展数据库( 商品库+ 自建库) 进行菌种鉴定，与16srDNA 测序鉴定结果一致则为鉴定正确，并记录鉴定分值，其判断标准如下：＞2.0 分，为确定种水平的鉴定，可能的种水平鉴定；1.7 ～1.999 分，为可能的属水平鉴定；＜1.7 为不可靠的鉴定。

6 统计学处理 采用SPSS19.0 统计软件对不同数据库的鉴定正确率进行统计分析，观测资料主要是计数资料，以例数及率表示，组间比较采用χ2检验。P ＜0.05 为差异有统计学意义。与16srDNA测序鉴定结果一致定义为鉴定正确。

结 果

1 自建海洋细菌数据库菌种信息及质谱图容量430 株菌经16srDNA 扩增测序后，9 株菌出现双峰或测序失败，故421 株菌用于构建数据库。自建数据库共包括了32 个菌属、82 个菌种、421 株细菌的质谱图，菌株详细信息见表2。

2 验证菌株来源与种类 从本课题组前期保存的海洋细菌库中随机选取海洋菌株100 株用于数据库验证，除1 株测序失败外，其余99 株经16srDNA测序获得菌种鉴定结果( 表3)，涵盖12 个菌属，29 个菌种，菌株种类的多样性有助于获得可靠的数据库验证结果。

3 各数据库鉴定准确率比较 分别用商品化数据库、自建数据库和扩展数据库对99 株菌株进行菌种鉴定，鉴定结果与16srDNA 测序一致时判断为鉴定正确，扩展数据库的鉴定准确率优于仪器自带的商品化数据库(98% vs 80%，P ＜0.001)。见表4。

讨 论

海洋细菌是海洋环境中分布最广、数量最大的一类微生物，其种类繁多，可通过各种途径引起人类相关感染，诊治不及时可危及生命[8-11]。海上作业人员是海洋细菌感染的高危人群，尤其是随着海军舰艇编队走向深蓝，海军官兵接触海洋细菌机会增多，引起相关感染风险增大，如食用被海洋细菌污染的食物导致肠道感染，治疗不及时可能引起群体性发病，影响任务执行力。此外某些种类的海洋细菌可通过破损的皮肤引起组织严重感染[12]，尤其是在战争条件下，伤员落水可能引起海洋细菌较为严重的感染，影响战斗力。因此对于海洋细菌引起相关感染的快速诊断和治疗至关重要。目前病原菌鉴定多采用传统的生化反应方法，操作烦琐且耗时，而分子生物学鉴定仅局限于少数已知特异性序列的细菌，覆盖面窄。近年来MALDI-TOF MS 突破传统方法鉴定耗时长、鉴定能力不足等弊端，在临床得以广泛应用[13-15]。然而实际应用中MALDI-TOF MS 存在对海洋细菌鉴定能力不足的问题，主要是数据库资源有限。有研究报道通过扩展数据库可提高某些目的菌种的鉴定能力[16-19]，本研究对海洋细菌MALDI-TOF MS 数据库的鉴定能力进行了验证。

表2 自建数据库菌种信息Tab. 2 Species information of in-house database

本研究利用菌株的资源优势建立的本地化海洋细菌MALDI-TOF MS 鉴定数据库，共包含32 个菌属、82 个菌种、421 株细菌质谱图。与商品化数据库相比，自建数据库新增了9 个菌属、22 个菌种、73 株菌的质谱图。新增菌属包括食烷菌、德库菌、大洋单胞菌、大洋杆菌、鞘氨醇杆菌、莱茵海默氏菌、固氮螺菌、卓贝尔氏菌和硝酸盐还原菌。自建数据库不仅在数量上丰富了商品化数据库，在菌株种类上，商品化数据库部分菌株来源于标准菌株，而自建数据库中的菌种均来源于海洋环境，更加贴近海洋细菌的鉴定需求。

表3 99 株用于数据库验证的菌株信息Tab. 3 Information of 99 strains used for database validation

表4 自建数据库与商品化数据库鉴定率比较Tab. 4 Comparison of identification rates of in-house and commercial databases

我们对自建数据库的鉴定能力进行了验证，99 株菌分别用自建数据库、商品化数据库和扩展数据库进行菌种鉴定，通过与金标准16srDNA 鉴定结果进行比对，原商品化数据库鉴定的正确率为80.8%。从鉴定分值来看，＞2.0 的只有44 株菌，＜1.7 的有5 株，尽管这5 株菌鉴定结果正确，但按照判断标准，＜1.7 的鉴定结果是不可信的，因此应用商品化数据库进行99 株菌的鉴定，只有75 株菌得到可靠的鉴定结果。自建数据库的鉴定正确率达到96.0%，94 株菌得到可靠的鉴定结果。扩展数据库的鉴定正确率高达98.0%，96 株菌得到可靠的鉴定结果。

研究中我们发现，即便是待鉴定菌株的种类存在于商品化数据库中，也难以与库中的谱图很好地匹配。如分离率较高、在海水环境中较为常见的溶藻弧菌，12 株中3 株错误鉴定为副溶血弧菌和需钠弧菌，其余9 株鉴定分数为1.7 ～ 1.99。分析原因可能是菌株的培养方式不同以及数据库中的菌种与待鉴定菌株之间地域来源不同，导致蛋白谱峰存在一定的差异，所以以各自实验室常规方式进行菌株的培养和前处理，建立来源广泛的菌株数据库，将有助于提高MALDI-TOF MS 的海洋细菌鉴定能力。

综上所述，本研究通过种类丰富的海洋细菌建立本地化的MALDI-TOF MS 鉴定数据库，扩展了商品数据库海洋细菌的种类和数量。经验证，扩展数据库能够提高海洋细菌的鉴定能力。之前未见建立此类数据库的报道，本研究建立的海洋细菌鉴定数据库可推广应用于普通民众、海洋作业人员感染病原的鉴定，同时也为海军官兵战创伤引发海洋细菌感染的诊治提供保障。