王 晨，郑祖艳△，苗永新，张琳琳

(1.哈尔滨工业大学附属黑龙江省医院，黑龙江 哈尔滨 150036； 2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

焦虑症是以焦虑为主要特征的神经症，根据《中国精神障碍分类与诊断标准》，焦虑症可分为GAD和PD两种类型[1]。临床上以GAD为多见，主要表现为过度忧虑，伴失眠、易激惹、坐立不安，或感到紧张、易疲劳、注意力不能集中等。临床药物治疗多采用选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRI)、三环类抗抑郁药(TCA)及苯二氮卓类药物等[2]。随着人们对药物治疗焦虑症导致副作用认知的深入，针刺治疗焦虑症的优势逐渐显现。头穴丛刺法现已广泛应用于治疗精神障碍类疾病，但有关机理研究尚不确切，故本研究从头穴丛刺治疗焦虑模型小鼠HPAA轴及分子机制角度出发，进一步证明头穴丛刺法对焦虑症的治疗作用，对临床有重要的指导意义。

本实验模拟人受到应激刺激的过程，从心理应激与生理应激两方面选择高架十字迷宫实验(EPM)[3-4],与间氯苯哌嗪(mCPP)共同诱导焦虑模型小鼠，基于此探讨头穴丛刺对焦虑症的治疗效果及作用机理，从而为临床治疗提供理论和科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级8周雄性SD小鼠60只，体质量180～200 g，实验动物由黑龙江中医药大学实验动物中心购买。室温(20±2)℃，自由食、水饲养；适应环境1周后正式实验。实验遵照《实验动物伦理与福利》等相关要求。

1.2 试剂与仪器

电子秤(天津医疗器械厂)，-70 ℃冰箱(日本日立公司)，安迪牌针灸针(0.25 mm×25 mm)，恒温高速离心机(日立公司)，电针治疗仪(鑫升实业有限公司)，BA200数码三目显微摄像系统(麦克奥迪公司)，Image-ProP-lus6.0图像分析系统(MediaCy-bernetics公司)，十字迷宫视频跟踪系统(泰盟科技有限公司)[5]。

1.3 造模方法与分组

造模方法参照Bondi CO等的方法[6],将小鼠随机分成3组，然后分别注射生理盐水、mCPP 1 mg/kg、mCPP 2 mg/kg,20 min后将小鼠置于EPM的平台处，使小鼠面对其中一个开放臂，释放后开始记录5 min内的以下指标：①OE(进入开臂次数)：以小鼠四爪均进入到臂内为准，一个爪子从该臂中完全退出则为结束；②OT(进入开臂时间)：单位为s；③CE(进入封臂次数)：标准同①；④CT(进入封臂时间)：单位为s；⑤OT%(开臂停留时间百分比)：开臂停留时间/总时间×100%；⑥OE%(进入开臂次数百分比)：进入开放臂次数/(OE+CE)×100%,并选择OT%和OE%最高的40只小鼠。通过SPSS20.0统计学软件对40只造模成功的小鼠进行随机分组，其中20只进入针刺组、20只进入模型空白组，另选20只不造模、不针刺的小鼠设为空白对照组。

1.4 针刺方法

造模成功后，将针刺组小鼠固定，参照《实验动物穴位图谱》定位，在顶前区及顶区分别以前神聪、百会、后神聪为中心,取穴为前神聪及前神聪两侧各旁开1寸及2寸平行线,百会两侧各旁开0.5寸及1.5寸平行线,以及后神聪及后神聪两侧旁开1寸平行线,共12针呈楔形分布[7]，针刺方法为向后平刺快速进针，使针刺入小鼠头皮下约20 mm，并迅速捻转，每日1次，每次15 min,连续治疗21 d，模型空白组与空白对照组同时进行与针刺组相同的固定，不进行针刺治疗。

1.5 行为学测试方法

各组小鼠在实验结束后第2天，再次进行EPM，即分别使3组小鼠面对其中一个开臂，释放小鼠后记录5 min内的OT%、OE%(具体行为学测试方法同造模方法)，经t检验进行统计。

1.6 取材及检测方法

行为学测定完毕后，各组小鼠立即用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，每组随机取鼠10只，经麻醉后取脑，分离小鼠下丘脑(含室旁核、杏仁核)，通过免疫组化法检测各组小鼠下丘脑内CRH、ACTH、CORT和NPY含量。采用酶联免疫法检测血浆中CRH、ACTH和CORT含量。每组另取剩余10只小鼠，分离出下丘脑，低温离心后取上层清液，应用RT-PCR技术检测下丘脑中NPY受体Y1 mRNA、Y5 mRNA水平。

1.7 统计方法

2 实验结果

实验造模及行为学测试过程中，各组小鼠无死亡。实验过程中，针刺组小鼠死亡1只(因无法耐受针刺)，其他两组小鼠实验过程中无样本损失。

2.1 各组小鼠EPM行为学复测比较

针刺组小鼠与模型空白组小鼠治疗前OT%、OE%比较，差异无统计学意义(P>0.05)，两组小鼠实验前差异无统计学意义。针刺组小鼠试验后与实验前比较，OT%、OE%均有所提高(P<0.05);与模型空白组小鼠实验后对比发现，针刺组OT%、OE%值升高显著(P<0.05);模型空白组与空白对照组对比可发现，模型空白组小鼠的OT%、OE%值明显下降(P<0.05)。EPM复测结果显示，EPM试验可使小鼠产生焦虑心理，且由于EPM实验复测可信度高[8-10]，说明本实验焦虑小鼠造模成功，且头穴丛刺法可显著改善小鼠的恐惧心理和焦虑行为。见表1。

表1 3组小鼠治疗前后行为学测试结果比较

2.2 3组小鼠血浆CRH、ACTH和CORT含量比较

针刺组与模型空白组比较P<0.05，说明头穴丛刺可改善小鼠血浆中CRH、ACTH和CORT的浓度。模型空白组与空白对照组相比，小鼠血浆CRH、ACTH和CORT浓度也发生明显变化(P<0.05)。见表2。

表2 3组小鼠血浆CRH、ACTH和CORT含量比较

2.3 3组小鼠下丘脑中CRH、ACTH、CORT和NPY含量比较

针刺组与模型空白组比较,差异有统计学意义(P<0.05)，说明头穴丛刺可显著改善模型小鼠下丘脑CRH、ACTH、CORT和NPY的浓度。模型空白组与空白对照组比较，CRH、ACTH、CORT和NPY浓度也发生明显变化(P<0.05)。见表3。

表3 3组小鼠下丘脑CRH、ACTH、CORT和NPY含量比较

2.4 3组NPY受体Y1 mRNA、Y5 mRNA含量比较

针刺组与模型空白组对比，差异有统计学意义(P<0.05)，可见头穴丛刺可明显降低小鼠下丘脑中NPY受体Y1 mRNA、Y5 mRNA含量，模型空白组与空白对照组比较，下丘脑中NPY受体Y1 mRNA、Y5 mRNA浓度提高明显(P<0.05)。见表4、图1～2。

表4 3组小鼠下丘脑NPY受体Y1 mRNA、Y5 mRNA含量比较

注：1～3为针刺组，4～6为模型空白组，7～9为空白对照组。图1 3组小鼠下丘脑NPY受体Y1 mRNA含量表达

注：1～3为针刺组，4～6为模型空白组，7～9为空白对照组。图2 3组小鼠下丘脑NPY受体Y5 mRNA含量表达

3 讨论

焦虑症是指以反复发作的焦虑或惊恐不安为主要特点的神经障碍性疾病，典型表现为偶然或持续的恐惧或忧虑感且难以自控，自主神经症状也可伴随出现[11-15]。中医学将焦虑症归属于“郁病”“奔豚气”“心悸”等范畴[16]，如《素问·举痛论》提到:“思则心有所存……故气结矣”。认为七情所致的情志郁结为主要病机。现代医学则认为焦虑症的发生受HPAA轴所分泌的激素水平的影响。由下丘脑室旁核神经元分泌的ADH(抗利尿激素)和CRH(促肾上腺皮质激素释放激素)，两者进一步刺激ACTH(促肾上腺皮质激素)的释放。ACTH也同时存在一条负反馈通路作用于下丘脑，在应激状态如焦虑、精神紧张时可激活HPAA轴，促使CRH、ACTH分泌增加。而肾上腺中CORT含量可反映HPAA轴功能是否发生变化。当CORT含量明显升高时对HPAA轴功能亢进有提示意义[17]。

头穴丛刺法应用于临床在治疗各种情志病方面早已取得显著疗效[18-19]。但相关实验研究结果比较匮乏，因此本实验从行为学及分子机制角度出发，实验结果表明头穴丛刺组小鼠治疗后行为学测试比较OT%、OE%均明显高于模型空白组及空白对照组。而头穴丛刺组小鼠血浆中CRH、ACTH、CORT含量及下丘脑中CRH、ACTH、CORT、NPY及其Y1 mRNA、Y5 mRNA受体含量在实验结束后较模型空白组及空白对照组均有显著改善。头穴丛刺的原理从神经解剖角度而言其主要刺激区域为顶区及顶前区，顶前区临近额叶，因此这两个区域的病变极大程度上可导致精神症状的发作，头穴丛刺法可以通过调节相应大脑皮层功能从而改善脑组织的病理状态[20-22]。从选穴角度来看，头穴丛刺针刺部位均在督脉巡行附近，“督脉者，起于下极之输……入属于脑。”脑为元神之府，是精神意识的主宰，督脉“入络脑”，百会为督脉穴位，根据经脉所过、主治所及的原理，头穴丛刺具有调理气机、健脑益智和疏经通络的作用，在治疗神志病方面有很大的优势。

因此，本实验研究结果表明，头穴丛刺具有通过抑制焦虑模型小鼠HPAA轴兴奋性降低CRF的分泌、改善小鼠焦虑症状的效果，可作为证实头穴丛刺治疗焦虑症有效的科学实验依据，但因本实验还存在某些不足之处，仍需进一步的实验研究加以论证。