王文秀,邱连利,刘 倩,丁凡帆,康晓文

(1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000; 2.甘肃省中医院，甘肃 兰州 730000)

脑卒中因高发病率、高致残率、高死亡率成为我国居民的主要死亡原因，而其中的缺血性脑血管类疾病又占全部脑血管疾病总数的60%～80%[1]，而细胞间黏附分子1(Intercellular adhesion molecules-1,ICAM-1)、基质金属蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9，MMPs-9)在脑水肿发生中的作用逐渐受到重视，主要体现于脑出血后炎症反应方面：当脑组织发生损伤时，血管内皮细胞随之受损，通透性进而增加并产生凝血活性物质，导致内皮细胞呈现为促凝状态，最终诱发血管出血及血栓，刺激ICAM-1、MMPs-9等炎症因子异常增高[2]，使血管舒缩活性物质不能正常表达，致使血管异常收缩，使脑缺血和卒中危险系数增大。对于缺血性脑受损来说，选择针灸方案进行医治存在着多路径、多成效、多靶点维护及干预的特征，能够限制局部病灶的扩散范围、促进脑组织循环及脑组织氧代谢、提离脑血流量与脑部对缺氧的可耐受程度。石学敏[3]医治中风3 207例,初次发病2 523例,治愈1 489例,治愈率达59.%,总有效率98.97%,而多次发病者684例,治愈322例,治愈率47.07%,总有效率为96.64%。因而可见,越是初期利用醒脑开窍针法治疗,其疗效就越明显;若是醒法治疗介入时机越晩,则中风病的致残率就越高。有研究[4]发现治疗后针灸治疗组神经功能缺损改善情况明显优于西医常规治疗组,并具备恶化率低的优势。针刺治疗因副作用小、效果显著、症状恢复稳定而愈来愈被普遍地应用到脑卒中后的医治体系中。本实验采用“醒脑开窍”针法，探讨“醒脑开窍”针法对大脑中动脉闭塞(MCAO)大鼠不同时相间ICAM-1 mRNA、MMPs-9 mRNA表达的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组

雄性SD大鼠144只,SPF级，来源：甘肃中医药大学实验室，体质量(280±20)g。实验动物生产许可证号：SCXK[甘]2015-0002；实验设施许可证号SYXK[甘]2015-0005。随机分为：脑缺血再灌注损伤模型组(对照组)、醒神开窍针法组(实验组)，再按照灌注4 h、缺血1 d、7 d、20 d各分为4个亚组，每组18只大鼠。

1.2 造模方法

采用由Longa等[5]改进的大脑中动脉二次线栓法。大鼠称体质量，按3.3 mL∶100 g药鼠比例,腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉，待折屈大鼠尾部无反应即为麻醉成功，麻醉后仰卧固定于大鼠板上颈部剃毛，碘伏消毒后偏颈部右侧做一切口，钝性分离出右侧颈总动脉(CCA)，此时可张开直镊扩大分离，在CCA近心端挂线备用，钝性分离颈外动脉(ECA)直至距离其与颈内分叉处远心端1 cm处，分离并挂线结扎ECA远心端，在近分叉处缝合挂线备用。钝性分离颈内动脉(ICA)和ICA的颅外分支-翼腭动脉。将ICA、CCA远心端用动脉夹夹闭，在距离分叉处远心端0.5 cm处将ECA用眼科剪剪一小口，插入碳素鱼线，减去多余缝合线，缝合皮肤,同时予青霉素钠肌注。造模后大鼠神经功能缺损评分为1～3分者,且处死后取脑可见大鼠脑梗塞灶位于缺血颞叶,此为大脑中动脉供血区域,代表实验大鼠造模成功。

1.3 针刺方法

选用“醒脑开窍”针刺法之主穴双“内关”“人中”。选穴根据《实验针灸学》[6]《大鼠穴位图谱的研制》[7],模拟人体腧穴骨度分寸法量取两穴。大鼠不麻醉，仰卧，大鼠腹部套封在塑制100 mL氯化钠输液瓶后固定，然后将四肢及头部固定在大鼠架上，采用华佗牌0.30 mm×0.25 mm规格针，先刺内关，并于两内关穴接电针治疗仪，疏密波(频率2 Hz)，刺激程度以双上肢轻微抖动为宜；人中穴留针10 min，内关两穴留针20 min。

1.4 检测指标

1.4.1 神经缺损行为体征与评分 采用Z-Longa法对各组实验大鼠进行神经功能评分，每次评分3次，求其平均值。评为4分：意识昏迷或者不能行走；评为3分:重度神经功能缺陷,向手术对侧倾倒；评为2分:中度神经功能缺陷,向手术侧的对侧转圈；评为1分：轻度神经功能缺损,表现为不能完全伸展手术对侧前爪。

1.4.2 脑组织ICAM-1 mRNA、MMPs-9 mRNA的表达 取两组大鼠的各个时间点，将各组6只大鼠在相应的时相点取材：用10%水合氯醛(0.35 mL/100 g体质量)腹腔注射麻醉，待麻醉成功后，快速沿左侧胸骨柄剪开肋骨，开胸暴露心脏，于右心耳剪开一小孔，迅速穿刺左心室，用50 mL注射器吸取37 ℃生理盐水灌注(灌注压为100 mmHg)，重复多次，致右心耳流出无色清亮液体，以清除血液中的染料，开颅取脑。对大脑(左侧)缺血组织进行逆转录聚合酶链法分析。Trizo(YESEN)试剂提取脑组织总RNA，经逆转录、扩增(试剂盒为TaKaRa产品)步骤取PCR扩增产物进行电泳实验，电泳结果用凝胶图像分析系统进行分析，反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线，确认得出数据的可信性。计算mRNA的相对表达量F=2-△△ct，平均数、标准差及P值。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能缺损评分比较

实验组和对照组两组大鼠术后即评定神经功能缺损症状，再灌注4 h、1 d、7 d到20 d，分别在相应时间点进行评分，结果显示，随着时间的延长，神经功能缺损评分逐渐减少，可以推测随时间的延长各组的神经功能有所恢复，评分逐渐下降，但实验组下降明显高于对照组，20 d两者的评分差异有统计学意义(P<0.05),见表1。由此可知：针刺可以有效改善脑缺血再灌注损伤后大鼠局灶性神经功能缺损症状，促进神经功能损伤的恢复。

表1 两组大鼠不同时间点神经功能缺损评分

2.2 各组大鼠ICAM-1 mRNA、MMPs-9 mRNA表达比较

大鼠造模后4 h、1 d、7 d及20 d，实验组与对照组相比较，实验组相应时间点ICAM-1表达均小于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05),见表2，pcr溶解曲线及扩增曲线分别见于图1、图2；大鼠造模后4 h、1 d、7 d及20 d，实验组与对照组相比较，实验组相应时间点MMPs-9表达均小于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05),见表3，pcr溶解曲线及扩增曲线分别见于图3～4。

表2 两组MCAO大鼠不同时相ICAM-1 mRNA表达

表3 两组MCAO大鼠不同时相MMPs-9 mRNA表达

图1 ICAM-1Real-time溶解曲线

图2 ICAM-1Real-Time扩增曲线

图3 MMPs-9Real-time溶解曲线

图4 MMPs-9Real-Time扩增曲线

3 讨论

经过大量查阅文献笔者选择体质量为(280±20)g的SD大鼠作为研究对象，原因如下：第一，体质量过小(<250 g)的大鼠对于麻药耐受性比较差，增加了死亡率，而且体质量较小的大鼠血管也较细，导致碳素鱼线难以插入；第二，体质量过大(>300 g)的大鼠血管变异的可能性大大增加，会使手术难度增加；第三，体质量>300 g的大鼠血管相应要粗很多，MCA的血流不能被线栓充分阻断，从而导致造模成功率下降。除此之外，性别对于该模型的影响不容小觑，笔者选择雄性大鼠是由于已有研究表明[7]，雌激素对神经具有保护作用，且雌激素的分泌具有周期性，而目前的技术尚不能准确计算雌激素水平，即实验干预因素不可控，而雄激素的分泌周期并不显著且对神经生理指标无太大影响。故体质量为(280±20)g的雄性SD大鼠更适合MCAO模型的制备。在前期造模预实验过程中，笔者发现尽管线栓已完全且顺利插入，但并未出现神经功能缺损症状，对此类造模不成功的大鼠进行解剖发现，是由于个别大鼠血管变异，需要插入线栓的深度与理论有一定的差距；另有大鼠在麻醉清醒时评分达3分,却于次日或隔日死亡，解剖发现大鼠颅底可见血凝块，推测由于线栓过程中手法太重，造成了蛛网膜下腔出血，因此在此实验过程中，不仅要明确实验动物的选择，亦要对造模插线的手法及时间予以精确掌握。本实验之所以选用MMPs-9、ICAM-1两个炎症因子作为观察指标是因为近年来，随着对脑缺血损伤机制的研究愈加深入，进行的相关研究亦随之表明，炎症因子的产生和发生作用是脑缺血损伤时的重要病理环节，因炎症因子会导致脑组织代谢异常，引起神经元损伤和凋亡[8]。ICAM-1能够在血管内皮细胞上表达，在炎性细胞因子以及内毒素等物质的刺激下表达率大幅度升高,当脑发生损伤时，TNF-α mRNA的表达会增加,进而对组织造成损伤，具体的机制：血管内皮细胞受损，通透性增加并产生凝血活性物质，导致内皮细胞表现为促凝状态，最终诱发血管出血及血栓[9]；刺激ICAM-1异常增高,使血管舒缩活性物质不能正常表达，致使血管异常收缩，进一步使得脑缺血以及局部卒中的危险系数增加；触发神经细胞凋亡机制导致细胞凋亡;而MMPs来源于血管平滑肌细胞、单核巨噬细胞以及内皮细胞中，其中与脑缺血及再灌注密切相关的主要为明胶酶A(MMP-2)、明胶酶B(MMP-9)。这两种MMPs被激活或活性上调，导致血脑屏障结构破坏，功能损伤，继而引起脑水肿和出血[10-11]。本实验中缺血再灌注损伤后4 h时，实验组、对照组大鼠脑组织MMPs-9 mRNA、ICAM-1 mRNA已大量表达，再灌注1 d时两组大鼠的两种炎症因子表达到最高峰，7～20 d，随时间的延长，两组大鼠脑组织MMPs-9 mRNA、ICAM-1 mRNA表达逐渐降低，且实验组低于对照组(P<0.05)；再灌注20 d时，实验组大鼠脑组织MMPs-9 mRNA、ICAM-1 mRNA的表达明显低于对照组(P<0.05)。因此，本实验证明，“醒脑开窍”针法可以通过抑制血清及脑组织中炎症因子ICAM-1、MMPs-9的表达，从而发挥对脑组织的保护作用，并且针刺时间越早、周期越长，其疗效也就越明显。但在脑缺血损伤过程中，影响血脑屏障的因素很多，本实验中笔者所涉及检测到的指标有限，然而体内微环境复杂，“醒脑开窍”针刺疗法是否通过其他方式减轻脑损伤，这些问题都需要在后续的研究中以待完善。