凌晓辉 陈佳鸿 陈志云 朱善文 刘利敏 陈光乐 柯洁荣

1 惠州市中心人民医院生殖中心(惠州 516001) 2 惠州市中心人民医院泌尿外科 (惠州 516001)

美国生殖医学协会将复发性流产定义为连续两次及以上流产。复发性流产目前已知的原因包括遗传因素，子宫解剖学因素，内分泌因素，免疫功能失调及易栓症[1]。但是50%夫妇原因不明确。过去，复发性流产夫妇主要是女方进行一系列的医学检查，而男方仅仅进行染色体筛查。研究表明染色体正常男性的精子仍存在非整倍体，男性配子提供50%受精需要的遗传物质[2]，所以基因异常或表观遗传学异常的精子仍可能同卵子受精。然而这种情况导致染色体损伤，而影响胚胎的早期发育。

许多研究证实精子DNA损伤同不育的发生、人工授精受孕率的降低及IVF/ICSI优质卵裂胚及囊胚形成概率的降低均密切相关[3]。精子DNA碎片率的检测能更好的评估男性生育力，有利于改善辅助生殖技术的成功率[4]。研究发现无症状的男性生殖道感染是男性不育的主要因素，12%～35%的男性伴侣感染引起不育[5-6]。精浆弹性蛋白酶指标增高是男性生殖道感染的指标[7]，但是弹性蛋白酶是否同复发性流产男性患者的精液参数与DNA碎片率相关亟待研究。

1 资料与方法

1.1 基本情况

回顾性分析2019年6月—2020年1月的惠州市中心人民医院生殖中心的复发性流产夫妇。复发性流产病例中，60例夫妇流产2次，16例夫妇流产3次，4例夫妇流产大于3次。夫妻双方均染色体核型正常。排除标准为女方年龄大于40岁、内分泌异常，子宫结构性畸形、抗磷脂抗体综合征及凝血障碍等；男方近三个月经历泌尿生殖道感染、发热病史、慢性系统性疾病、过量饮酒、高温环境、辐射暴露及抗氧化治疗等。另外，选择25例夫妇2019年1月—2020年1月在我科因女方输卵管因素行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)，其余排除标准同复发性流产病例，女方均行IVF-ET后生育后代或怀孕至三个月以上，这些男性患者作为弹性蛋白酶比较的对照组。我们将复发性流产男性患者按弹性蛋白酶的参考值分为两个组别：正常组(<600 ng/mL)及异常组(≥600 ng/mL)。本项研究惠州市中心人民医院伦理委员会批准。

1.2 精液分析

禁欲2～7天采集精液标本，精液液化后，称重法计算体积，计算机辅助精液分析系统(CASA)检测精液的量、pH值、活力、浓度及前向运动比例，前向运动精子总数(TMSC)=精液量×浓度×前向运动比例。精子形态学分析严格按照WHO第五版《人类精液检查及处理实验室手册》执行。高倍显微镜分析精子的顶体、头、颈、中段及尾。精液标本经涂片、染色后，×100显微镜下观察并计数精子形态。

1.3 精浆弹性蛋白酶的检测

试剂盒由深圳博锐德生物科技有限公司提供。留取精浆10 μL，加入标本稀释液500 μL，混匀，同时制备校准品。将5个标准品及精浆样品加入包被微孔，胶膜封板并孵育，洗板。每孔加入酶结合物100 μL，孵育后洗板。每孔先后加入显色液及终止液后，15 min内450/630 nm比色，并标准曲线拟合。试剂盒推荐的正常参考值标准为<600 ng/mL。

1.4 精子染色质扩散试验(SCD)

精子DNA的完整性采用精子染色质扩散实验检测，试剂盒由深圳博锐德生物科技有限公司提供。运用普通显微镜(400×)镜头，选取并观察500个染色精子，计数存在DNA碎片的精子数量。精子DNA碎片的判断标准如下：精子头部仅产生较小的光晕或无光晕，单侧光晕的厚度不超过精子头部最小直径的1/3。精子DNA碎片化率(%)=存在DNA碎片精子数÷被观察精子总数×100%。试剂盒推荐的正常参考值为精子DNA碎片率<25%。

1.5 统计分析

数据分析采用SPSS 17.0软件，连续性变量运用均数±标准差表示，复发性流产及对照组数据的比较采用两独立样本的t检验或秩和检验。Spearman相关分析探讨精浆弹性蛋白酶同精子活力、正常形态百分率及精子DNA碎片率的关系。所有指标均双侧检测(two-sided test)，P<0.05被认为是差异有统计学意义。

2 结 果

首先检测80例复发性流产男性患者及20例正常生育男性的精浆弹性蛋白酶水平，我们发现同对照组相比，复发性流产男性患者的弹性蛋白酶是增高的(102.32±54.07 vs 605.98±864.72，t=6.53，P=0.010)。

其次，我们对复发性流产男性患者的不同精浆弹性蛋白酶水平下，男方年龄、精液量、pH值、精子活力、浓度、总数、精子形态及DNA碎片率进行差异比较(表1)。按照精浆弹性蛋白酶的参考值，将复发性流产男性分为正常组(<600 ng/mL)及异常组(≥600 ng/mL)。我们结果显示，两组的年龄(t=1.58，P=0.119)、精液量(t=-0.62，P=0.538)、pH值(t=1.24，P=0.685)、精子浓度(t=0.06，P=0.953)及总数(t=-0.39，P=0.697)均无差异；同弹性蛋白酶正常组患者相比，异常组患者的精子前向运动比例(t=3.52，P=0.002)及正常形态百分率(t=-2.66，P=0.009)均降低，而精子DNA碎片率(t=3.51，P=0.001)增高。

表1 复发性流产患者不同弹性蛋白酶水平的相关参数比较

最后，Spearman相关性分析发现精浆弹性蛋白酶同精子前向运动比例(r=-0.43，P<0.001；图1A)及正常形态百分率(r=-0.39，P<0.001；图1B)负相关，而同精子DNA碎片率(r=0.36，P=0.001；图1C)正相关。

图1 精浆弹性蛋白酶同精子参数的相关性分析

3 讨 论

生殖道感染期间，激活的粒细胞分泌弹性蛋白酶和染色质，其坏死或凋亡后会形成胞外杀菌网络，继续杀灭细菌。精液白细胞及精浆弹性蛋白酶指标是判断男性生殖道感染的重要指标[8]。粒细胞是活性氧产生的机器，能够破坏精子DNA及细胞膜，从而影响精子参数。男性不育患者发生弹性蛋白酶升高的可能性更高[9]，研究也发现弹性蛋白酶增高影响卵裂胚向囊胚的进展，说明生殖道感染同生育潜能密切相关[10]。

精子DNA完整性在胚胎发育及胎儿健康方面发挥着重要作用且DNA碎片率也作为评估复发性流产的关键指标[11]。目前常用于检测精子DNA碎片率的方法包括精子染色质结构分析法(SCSA)、末端转移酶介导的dUTP末端标记法(TUNEL)及精子染色质扩散法(SCD)。精子异常同凋亡密切相关，机制可能跟睾丸精子发生过程中细胞核重塑错误有关[12]。精子凋亡可见于精子冷冻及毒素暴露的环境。并且，生殖道感染的男性，其凋亡靶标基因的表达也是异常的。实验表明，弹性蛋白酶抑制剂增加细胞的生存可能，并且其能够恢复细胞的活力[13]。活性氧(ROS)能够诱导细胞质膜的对称性，白细胞及活性氧的增加同基质金属蛋白酶(MMP)表达的降低及DNA碎片的增加密切相关[7]。

虽然许多研究发现复发性流产同精子DNA碎片率显著正相关，其影响机制尚不明朗。精子DNA完整性是遗传物质能够正确传递给后代的必需条件，DNA损伤能够增加流产的概率。一些研究发现DNA碎片率随着年龄的增长而升高。DNA碎片的产生主要是外部因素引起，包括氧化应激，而不是细胞程序化死亡[14]。目前治疗也是抗氧化治疗为主，研究发现口服抗氧化药物治疗能够降低精子DNA碎片率[14]。DNA链断裂常发生在减数分裂的过程，氧化应激能够诱导DNA退化而导致单链和双链断裂；DNA损伤的精子能够同卵子结合并受精，而父系基因的激活影响早期胚胎的发育[15]。

为了探讨泌尿生殖道感染同男性不育的关系，有研究发现：当精液白细胞及精浆弹性蛋白酶稍增加时，男性不育患者精子坏死及DNA变性的概念明显增加[7]。Kopa等研究纳入340例男性不育患者的精液样本，发现101例患者(29.7%)弹性蛋白酶浓度为250～1 000 ng/mL,21例患者(6.2%)的弹性蛋白酶浓度大于1 000 ng/mL[7]。并且国内外研究发现弹性蛋白酶同男性不育患者的精子前向运动比例、正常形态百分率及DNA完整性显著负相关[16-17]。复发性流产男性患者的精浆弹性蛋白酶同精子参数的关系，未见相关报道。我们研究也表明复发性流产男性患者精浆弹性蛋白酶的增高同精子活力及正常形态精子百分率负相关，而同精子DNA碎片率是正相关的。这说明复发性流产男性患者的生殖道感染同精子参数是密切联系的。

总之，由于炎症影响精液质量的事实经常被忽略，复发性流产男性患者的生殖道隐性感染值得重视，其相关临床探讨性值得深入研究。