李燕玲 林国伟 梁伟海 刘晓俊

广州市第一人民医院 (广州 510180)

卒中后认知功能障碍(post-stroke cognitive impairment, PSCI)是指卒中后6个月内，出现认知功能障碍的综合征。PSCI作为卒中后常见的并发症，给个人、家庭及社会都造成了严重的影响。西医认为PSCI与动脉硬化密切相关[1]，而动脉硬化又多责之氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)对血管的损害。中医认为PSCI与气、血、痰、瘀、郁等有关，由脑髓空虚、精气血不足、气滞血瘀、痰浊阻窍、阴阳失调等所致，治疗上多遵补肾填精、理气化痰、益智醒脑、活血补血等法[2]。全国名老中医刘茂才教授根据上述理论及丰富的临床经验，选用紫河车、巴戟天、制何首乌、黄芪、半夏、当归等中药组成痴复康方，其中又以制何首乌、巴戟天等取补肾填精之妙。大量的临床研究表明，痴复康能有效增加PSCI患者的大脑血流量、改善脑循环，促进脑细胞恢复，从而改善痴呆症状[3]。痴复康选用制何首乌、巴戟天以补肾填精法治疗PSCI，故笔者特选制何首乌、巴戟天及二者配伍，从其对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)损伤的影响，以窥探补肾填精法治疗PSCI的现代医学原理，以示临床。

1 材料与方法

1.1 细胞 HUVEC

1.2 药材

制何首乌，巴戟天(广州市药材公司中药饮片厂，批号分别YPA8C0001，YPA8G0002)

1.3 试剂

DMEM培养基(HyClone，批号SH30809.01B)，胎牛血清(Gibco，批号1027-106)，胰蛋白酶，PBS(博士德，批号PYG14190)，氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)，CCK8试剂盒(碧云天)，trypsin-EDTA溶液(BIOSHARP，批号WH0518)，双抗(青霉素/链霉素原液)(TBD，批号PS2004HY)，Propidium Iodide/碘化丙啶(碧云天，批号ST512)，RNase A酶(SIGMA，批号R4875)，Annexin V-APC /7AAD kit(联科生物，批号4224750)，高纯总RNA快速提取试剂盒(BIOTEKE，批号RP1201)，HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)(Vazyme，批号R223-01)，HieffTMqPCR SYBR? Green Master Mix (LoWRox Plus)(翊圣生物，批号11202ES08)，DL 2000 DNA marker(TAKARA，批号3427B(Ax2))，琼脂糖(BIOWEST，批号G10)。

1.4 仪器

SW-CJ-2F型净化工作台(苏州净化有限公司)，水套式二氧化碳培养箱(Thermo)，普通光学显微镜(尼康)，多功能酶标仪(Thermo)，水平离心机(湖南湘义离心机仪器有限公司)，涡旋混匀器(其林贝尔仪器制造有限公司)，纯水机(厦门锐思捷水纯化技术有限公司)，冰箱(青岛海尔股份有限公司), 流式分析仪(爱森生物有限公司)，荧光定量PCR仪(博日公司)，Tanon-1600凝胶成像系统(天能公司)，JY200C电泳仪(君意公司)，超微量核算分析仪Nano-200(杭州奥盛)。

1.5 制何首乌、巴戟天对ox-LDL诱导HUVEC增殖和相对活率的影响

1.5.1 分组与给药 实验分为8组，每组6个平行样：空白对照组(正常培养的HUVEC)；模型组(正常培养的HUVEC，加入80 μg/mL ox-LDL[4]诱导)，制何首乌低、中、高剂量组(模型组中分别加入不同浓度5、10、20 mg/mL的制何首乌水煎煮物)[5-6]，巴戟天低、中、高剂量组(模型组中分别加入不同浓度5、10、20 mg/mL的巴戟天煎煮物)[7]。

1.5.2 步骤 在96孔板中接种2 000个HUVEC悬液(100 μL/孔)。将培养板放在培养箱中预培养24 h(37 ℃,5% CO2)，弃上清，用PBS缓冲液洗2次，模型组加入含80 μg/mL ox-LDL的DMEM培养基，样品组加入含不同浓度的制何首乌，巴戟天，制何首乌+巴戟天的DMEM培养基。样品干预48 h后,向每孔加入10 μL CCK8溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数)。将培养板在培养箱内孵育0.5～4 h。用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

1.6 制何首乌、巴戟天对ox-LDL诱导HUVEC凋亡的影响

1.6.1 分组与给药 实验分为5组，每组6个平行样：空白对照组(正常培养的HUVEC)；模型组(正常培养的HUVEC，加入80 μg/mL ox-LDL诱导)，制何首乌组(模型组中加入10 mg/mL的制何首乌水煎煮物，即以上细胞相对活率实验测得的最佳制何首乌浓度)，巴戟天组(模型组中加入10 mg/mL的巴戟天煎煮物，即以上细胞相对活率实验测得的最佳巴戟天浓度)，制何首乌巴戟天配伍组(模型组中加入10 mg/mL的制何首乌，10 mg/mL巴戟天水煎煮物)。

1.6.2 步骤 细胞消化，取药物处理完成后的细胞，消化收集细胞，PBS洗一次，再用1×Binding Buffer洗一次。制备细胞悬液，用1×Binding Buffer重悬细胞，并计数。孵育染料，每个样品中加入100 μL 1×Binding Buffer，确保每管的细胞数为1×105～1×106个，加入5 μL Annexin V-APC和10 μL 7AAD，轻柔涡旋混匀后室温避光孵育15 min。无需洗涤，每管加入485 μL预冷 1×Binding Buffer重悬混合。送流式细胞仪检测，Flowjo分析数据。

1.6.3 不同药物对ox-LDL诱导下HUVEC细胞周期的影响

1.6.4 分组与给药 同1.6.1。

1.6.5 步骤 细胞消化，取细胞生长状况良好，密度适中的细胞，在超净台中消化收集细胞，弃上清，用预冷PBS洗细胞两次。细胞固定，加入预冷70%乙醇重悬，于4 ℃固定过夜，或-20 ℃长期固定。细胞染色，离心收集细胞，1 mL PBS洗细胞一次，加入500 μL PBS [含5 μg/mL碘化丙锭(PI)]，100 μg/mL RNaseA，0.2%Triton X-100)4 ℃避光孵育30 min。流式细胞仪分析，以标准程序用流式细胞仪检测，计数1×105个细胞以上。数据分析，结果用细胞周期拟合软件Flowjo分析。

1.7 qPCR法鉴定ox-LDL诱导下HUVEC中Caspase-3、Caspase-9 mRNA的表达量

1.7.1 分组与给药同1.6.1。

1.7.2 步骤 根据表1进行设计引物，根据试剂说明书提取总RNA，收集各组细胞沉淀，准备PCR反应管，依次在管中加入20 μL反应体系，并于 qPCR仪上反应。

表1 引物设计

1.8 统计分析

2 结 果

2.1 制何首乌、巴戟天对ox-LDL诱导HUVEC细胞增殖和相对活率的影响

与空白组比较，制何首乌高剂量组的细胞增殖OD值下降(P<0.000 1)，巴戟天高剂量组的细胞增殖OD值下降(P<0.000 1)，以上药物剂量具有细胞毒性；与空白组比较，制何首乌低剂量组细胞增殖OD值无下降(P=0.305)，制何首乌中剂量组细胞增殖OD值上升(P<0.000 1)、巴戟天低剂量组细胞增殖OD值上升(P<0.000 1)，巴戟天中剂量组细胞增殖OD值上升(P<0.000 1)，说明无细胞毒性。与空白组比较，模型组细胞相对活率下降(P<0.000 1)，细胞损伤模型制备成功。与模型组比较，制何首乌低剂量组细胞相对活率增高(P=0.001)，制何首乌中剂量组细胞相对活率增高(P<0.000 1)、巴戟天低剂量组细胞相对活率增高(P<0.000 1)，巴戟天中剂量组细胞相对活率增高(P<0.000 1)，巴戟天高剂量组细胞相对活率增高(P<0.000 1)，其中10 mg/mL制何首乌、10 mg/mL巴戟天细胞活率最好。见表2。

表2 制何首乌、巴戟天对HUVECs细胞 增殖和相对活率的影响

2.2 制何首乌、巴戟天对ox-LDL诱导下HUVEC细胞凋亡的影响

与空白组相比，模型组的凋亡率增高(P<0.000 1)，表明ox-LDL诱导HUVEC凋亡，模型制备成功。与模型组比较，制何首乌组的凋亡率降低(P<0.000 1)，巴戟天组的凋亡率降低(P<0.000 1)，制何首乌巴戟天配伍组的凋亡率降低(P<0.000 1)，说明制何首乌、巴戟天、制何首乌巴戟天配伍均有抑制ox-LDL诱导HUVEC细胞凋亡作用。与制何首乌组比较，巴戟天组凋亡率降低(P<0.000 1)，制何首乌巴戟天配伍组凋亡率降低(P<0.000 1)；与巴戟天组比较，制何首乌巴戟天配伍组凋亡率无统计学差异(P=0.260)，说明巴戟天抑制ox-LDL诱导HUVEC细胞凋亡作用强于制何首乌，制何首乌巴戟天配伍抑制ox-LDL诱导HUVEC细胞凋亡作用强于单味中药制何首乌。见图1、表3。

图1 制何首乌、巴戟天对ox-LDL诱导HUVECs细胞凋亡的影响注：A. 为空白组；B. 为模型组；C. 为制何首乌组；D. 为巴戟天组；E. 为制何首乌巴戟天配伍组

表3 制何首乌、巴戟天对ox-LDL诱导HUVECs细胞凋亡的影响 (n=6)

续表

2.3 制何首乌、巴戟天对ox-LDL诱导HUVEC细胞周期的影响

与空白组相比，模型组的(S+G2)%期降低(P<0.000 1)，表明ox-LDL诱导HUVEC损伤，模型制备成功。与模型组比较，制何首乌组的(S+G2)%期增高(P=0.014)，巴戟天组的(S+G2)%期增高(P=0.002)，制何首乌巴戟天配伍组的(S+G2)%期均增高(P<0.000 1)，说明制何首乌、巴戟天、制何首乌巴戟天配伍均有抑制ox-LDL诱导HUVEC损伤作用。与制何首乌组比较，巴戟天的(S+G2)%期无差异(P=0.441)，说明制何首乌、巴戟天抑制ox-LDL诱导HUVEC损伤的作用相似。与制何首乌组比较，制何首乌巴戟天配伍组的(S+G2)%期增高(P<0.000 1)，与巴戟天组比较，制何首乌巴戟天配伍组的(S+G2)%期增高(P<0.000 1)，说明何首乌巴戟天配伍抑制ox-LDL诱导HUVEC损伤作用强于单味中药制何首乌、巴戟天。见表4、图2。

图2 制何首乌、巴戟天对ox-LDL诱导HUVECs细胞周期的影响注：A. 为空白组；B. 为模型组；C. 为制何首乌组；D. 为巴戟天组；E. 为制何首乌巴戟天配伍组

表4 制何首乌、巴戟天对ox-LDL诱导HUVECs细胞周期的影响 (n=6)

2.4 制何首乌、巴戟天对ox-LDL诱导HUVECs中NFκB mRNA表达的影响

与空白组相比，模型组的NFκB mRNA的表达量高于空白组(P<0.000 1)，模型制备成功。与模型组相比，制何首乌组的NFκB mRNA的表达量下降(P<0.000 1)，巴戟天组的NFκB mRNA的表达量下降(P<0.000 1)，制何首乌巴戟天配伍组的NFκB mRNA的表达量下降(P<0.000 1)。与制何首乌组比较，巴戟天组的NFκB mRNA表达量下降(P<0.000 1)，说明制何首乌抑制ox-LDL诱导HUVECs中NFκB mRNA表达的作用强于巴戟天。与制何首乌组比较，制何首乌巴戟天配伍组的NFκB mRNA表达量下降(P<0.000 1)；与巴戟天组比较，制何首乌巴戟天配伍组的NFκB mRNA表达量下降(P<0.000 1)，说明制何首乌巴戟天配伍下调NFκB mRNA表达的作用强于单味中药制何首乌、巴戟天。见表5。

表5 制何首乌、巴戟天对ox-LDL诱导 HUVECs中NFκB mRNA表达的影响

3 讨 论

西医认为动脉粥样硬化(AS)是卒中的病理学基础，而ox-LDL从多个途径促进AS的发生发展。ox-LDL可以刺激内皮细胞多种炎症因子、黏附分子的表达，如单核细胞趋化蛋白-1、血管细胞黏附分子-1等[8]，诱导单核细胞迁移进入动脉内膜转化为巨噬细胞[9]。ox-LDL本身有细胞毒作用，且比LDL更快地与巨噬细胞表面受体结合，促进巨噬细胞吞噬形成泡沫细胞，而泡沫细胞形成是整个AS进程中的最重要的病理学标志[10]。ox-LDL不仅促进AS形成，还促进AS斑块破裂、触发脑卒中事件发生，而我国卒中后认知功能障碍发生率约为55.9%[11]。

PSCI属于中医“呆病”、“善忘”、“癫证”、“郁证”等范畴，《医林改错》认为“灵机记性不在心在脑”，故病位在脑。《灵枢·经脉篇》：“人始生，先成精，精成后而脑髓生。”《素问·五脏生成论》：“诸髓者，皆属于脑。”故脑为髓海。肾为先天之本，肾藏精，精生髓，故脑髓与肾息息相关。肾精充足，则髓海之源不断，元神之府得安。肾虚不生髓，则脑髓空虚，元神不安，则出现头晕、耳鸣、目眩、健忘、嗜睡、痴呆等症状。痴复康治疗PSCI有显效，通过改变患者的血液流变学、抗血小板凝聚、降低血液中的胆固醇和甘油三酯，升高高密度脂蛋白[12]等增加大脑血流量，维护脑细胞功能，改善学习能力、记忆功能[13]、卒中后前瞻性记忆障碍[14]，改善痴呆症状。本实验选用痴复康方中的制何首乌、巴戟天，通过探讨二药及其配伍对ox-LDL诱导的HUVEC损伤的影响，认为制何首乌、巴戟天通过抑制ox-LDL诱导的HUVEC凋亡以及NFκB mRNA的表达、延长ox-LDL诱导的HUVEC的细胞周期(S+G2)%，从而达到抑制动脉硬化、治疗PSCI的效果。这也是对实验法对补肾填精法治疗PSCI的佐证初探，希望将来有更多的研究提供证据。