曲见松，张 娟，耿 雪，魏 霞，祝清芬

(山东省食品药品检验研究院，国家药监局仿制药研究与评价重点实验室，山东 济南 250101)

药品杂质限度控制是药物质量标准研究的重要内容[1]。近年来，国际上对药物杂质的遗传毒性越来越重视，EMA、美国FDA 等先后颁布了遗传毒性杂质(genotoxic impurities，GTIs)控制的指导原则[2-4]，2014年，ICH 正式发布了M7 指导原则：为控制潜在的致癌风险的DNA 反应性(致突变性)药物杂质的评价和控制，对具有DNA 活性(致突变性)的杂质的控制提出了通用的要求，目前已在各成员国药品注册中使用[5]。

硝苯地平用于预防和治疗冠心病心绞痛，特别是变异型心绞痛和冠状动脉痉挛所致心绞痛。还适用于各种类型的高血压，对顽固性、重度高血压也有较好疗效。由于能降低后负荷，对顽固性充血性心力衰竭亦有良好疗效。目前是临床最常用的药物之一。硝苯地平质量标准中，收载了杂质Ⅰ和杂质Ⅱ两个已知杂质[6]。按照ICH M7 指导原则的要求，采用(定量)构效关系计算机模型[(Q)SAR]技术对硝苯地平的已知杂质进行了筛查。并对预测为阳性的杂质进一步采用体外试验，用细菌回复突变试验(Ames试验)对其致突变性进行了确证。

1 材料与方法

1.1 遗传毒性(Q)SAR 评价模型

1.1.1Derek 版本：Derek Nexus: 6.0.1，数据库：Derek KB 2018 1.1，数据库版本：1.1，数据库日期：2017年11月23日，英国Lhasa公司研制(http://www.lhasalimited.org/)。Derek用于杂质遗传毒性预测，基本设置为：物种设为细菌(bacterium)，预测终点设置为遗传毒性(genotoxicity)项下的致突变性(mutagenicity)。

1.1.2Sarah 版本：Sarah Nexus: 3.0.0，模型：Sarah Model 2.0，模型版本：2.0。英国Lhasa公司研制(http://www.lhasalimited.org/)。

1.1.3Nexus 版本：Nexus: 2.2.1，英国Lhasa公司(http://www.lhasalimited.org/)旗下Derek、Sarah、Vitic、Meteor、Zeneth等软件的整合平台。

在Nexus 系统中，使用Derek 和Sarah 进行遗传毒性评价，也可以分别使用2 个软件。同时，Nexus 系统中已固化了组合的ICH M7 模式(ICH M7 prediction)，并能够采用ICH M7 分类模式(ICH M7 batch classifcation)对杂质遗传毒性进行预测和分类。

1.2 菌株鼠伤寒沙门菌TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535，均购自上海宝录生物科技有限公司。经鉴定符合要求。

1.3 试剂和药品硝苯地平杂质Ⅰ(含量99.3%， 30 mg/支，中国食品药品检定研究院)，硝苯地平杂质Ⅱ(含量99.7%，30 mg/支，中国食品药品检定研究院)，代谢活化系统S9(批号：3516，诱导剂及动物品种：Aroclor1254诱导♂ SD大鼠，上海宝录生物科技有限公司)，6-磷酸葡萄糖(批号：LAZ0O01，北京百灵威科技有限公司)；NADP(批号：20120927国药集团化学试剂有限公司)；营养肉汤培养基(批号：3302027，广东环凯微生物科技有限公司)；琼脂粉(批号：20150606，北京奥博星生物科技有限责任公司产品)，敌克松(Dexon，批号：10112926，上海晶纯试剂有限公司)；环磷酰胺(CP，批号：SLBG4216V, ：SIGMA-ALDRICH公司)，注射用丝裂霉素(批号：131101, 浙江海正药业股份有限公司)，2-氨基芴(批号：13152，上海晶纯试剂有限公司)，1,8-二羟基蒽醌(批号WXBB7902V，美国SIGMA-ALDRICH公司)；灭菌注射用水(批号：14052501，河南省康华药业股份有限公司。)

1.4 (Q)SAR评价方法采用Chemdraw 12.0 绘制药物(API)及杂质的化学结构图，分别为硝苯地平及其2个杂质杂质Ⅰ、杂质Ⅱ(Fig 1)，输入Nexus2.1.0，采用ICH分类模式进行预测。

Fig 1 Structures of nifedipine and impurities A:nifedipine; B: impurity 1, C: impurity 2

1.5 Ames试验方法实验采用平板掺入法。将冷冻保存的试验菌株培养物TA97，TA98，TA100，TA102，TA1535分别接种于营养肉汤培养基10 mL，37 ℃振荡(100次/min)培养10 h。将含0.5 mmol·L-1组氨酸-0.5 mmol·L-1生物素的顶层培养基2.0 mL分装于试管中灭菌，50 ℃水浴中保温，然后每管依次加入试验菌株增菌液0.1 mL, 受试物溶液0.1 mL和S9-混合液0.5 mL(需代谢活化时)，充分混匀，迅速倾入底层琼脂平板上，转动平板，使之分布均匀。水平放置待冷凝固化后，倒置于37 ℃培养箱里孵育48 h，计数每皿回变菌落数。每个剂量均做3个平行板，同时设空白对照组(自发回变组)、溶剂对照组和阳性对照组。

至少在一个菌株上，在有或无代谢活化的情况下，受试物所诱发的回复突变菌落数出现浓度依赖性的增加和/或在一个或多个浓度组上出现可重复的增加，可判定为阳性结果，否则，结果为阴性[7-9]。

2 结果

2.1 (Q)SAR评价结果结果见Tab 1，杂质Ⅰ、杂质Ⅱ预测结果Derek为貌似可信的(plausible)，Sarah分别为阳性(positive)和阴性(negative)，由于警示结构不存在与硝苯地平中，分类为3类。

Tab 1 (Q)SAR prediction summary for genotoxicity of impurities

2.2 Ames试验结果试验结果见Tab 2、3。在加与不加代谢活化系统的情况下，硝苯地平杂质Ⅰ和杂质Ⅱ在5 000、1 000、200、40 μg/皿剂量时，对TA97a、TA98、TA100、TA102和TA1535诱导回变菌落数与溶剂对照组相比，差异均无统计学意义，且未呈现浓度依赖性增加，各试验菌株溶剂对照组和自发回变组的回变菌落数均落在正常范围内，阳性对照组回变菌落数均超过溶媒对照组2倍以上。说明在本试验条件下，受试物对鼠伤寒沙门氏菌为致突变阴性。

Tab 2 Results of Ames test for impurity

Tab 3 Results of Ames test for impurity

3 讨论

致突变性杂质的危害评估方法主要是通过数据库、文献检索，(定量)构效关系[(Quantitative) structure-activity relationships，(Q)SAR]评估以及遗传毒性试验等评估方法将杂质分类，参考国际相关分类方法，根据致突变和致癌风险危害程度可将杂质分为5类，其中1、2、3 类需按照遗传毒性杂质进行严格控制[10]。

采用(Q)SAR评价通过警示结构(structural alerts)预测化合物的遗传毒性已经有30 多年的历史[11]。ICH M7 指导原则最显著的特点之一是引入了(Q)SAR 评价的概念。应用(Q)SAR方法进行计算机模拟，预测细菌回复突变试验的结果时，应采用两个互补的(Q)SAR预测方法。一个方法基于专家规则，另一个方法基于统计学。如果两个互补的(Q)SAR方法预测结果均没有警示结构，则可以认为该杂质没有致突变性，不建议做进一步的检测。已有研究对包括Derek、Sarah 等软件组合的预测效果进行评价，Derek 和Sarah 的组合符合OECD 的认证体系，并为美国FDA等认可。

(Q) SAR评估方法是根据化合物警示结构和对细菌回复突变试验的预测对化合物进行分类。如果杂质含有与原料药结构无关的警示结构，但无致突变性数据，则可归为3类；如果杂质含有与原料药或与原料药相关的物质相同的警示结构(例如，工艺中间体)，且该原料药或与原料药相关的物质经测试为无致突变性，则可归为4类。

对于致突变性计算机评价的结果，可以进行专家分析，以确认或者否定。另外，对于应用(Q)SAR方法评估归为3类的杂质，可以进一步开展细菌回复突变试验。如果试验结果为阳性，则该杂质可以归为2类；如果试验结果为阴性，则该杂质可以归为5类。

本次(Q)SAR评价发现硝苯地平的2个杂质为3类遗传毒性杂质，应根据ICH M7 指导原则的要求进行严格控制或进一步实验研究提供充分的实验数据。本试验采用Ames试验对杂质的遗传毒性进行进一步验证。试验结果显示，硝苯地平杂质Ⅰ、杂质Ⅱ在40～5 000 μg/皿的范围内，在S9存在或不存在的情况下，试验结果均为阴性。

综上所述，本次研究的杂质Ⅰ、杂质Ⅱ均为遗传毒性阴性，可以按照一般杂质进行控制。