徐 非，马欣雨，龚蕾蕾，刘艺筱，程蕊棠，朱雨薇，缪孙涵，邱丽颖

(江南大学无锡医学院，江苏 无锡 214122)

动脉粥样硬化是一种常见的动脉血管疾病，特点是脂肪和纤维堆积使动脉弹性降低、管腔变窄[1]。随着人们生活水平的提高，动脉粥样硬化发病率逐年上升，并趋于年轻化。因此，探索干预动脉粥样硬化的新型药物，从而改善动脉粥样硬化的治疗效果，是迫切需要突破的科学问题。

动脉粥样硬化是一种受多因素影响的炎症反应和脂类平衡紊乱性疾病。目前认为氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein， ox-LDL)是引起动脉粥样硬化的始动及核心要素。ox-LDL是一种氧化应激损伤蛋白，不经常规LDL受体途径代谢，而是由清道夫受体(CD36)和ox-LDL受体(lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1，LOX1)识别并内吞进入细胞，引起胞内脂质沉积和泡沫样改变[2]。动脉粥样硬化最早的病变过程是单核细胞趋化至血管内皮下的间隙，分化为巨噬细胞。巨噬细胞随后可使侵入到内膜下的脂蛋白发生氧化，产生ox-LDL，使其丧失与LDL受体结合的能力。ox-LDL可与巨噬细胞表面的清道夫受体结合。清道夫受体与LDL受体不同，不受胞内胆固醇水平高低的限制，使得脂质在巨噬细胞内大量积聚，并逐步转变为富含大量胆固醇的泡沫样细胞[3]。活性氧(reactive oxygen species，ROS)是氧化应激过程的主要参与者。ROS是心血管疾病中重要的危险因子之一，参与了包括细胞炎症在内的病理过程。p38/MAPK信号通路能够被不良刺激如ROS，激活并介导发生炎症反应[4],进而参与胞内脂质沉积过程。

王不留行是石竹科植物麦蓝菜[vaccariasegetalis(Neck.) Garcke]的种子，王不留行黄酮苷(vaccarin)是从王不留行中分离纯化的天然有活性的黄酮苷[5]。本课题组近年来的研究发现，vaccarin可通过抑制Notch信号通路从而保护内皮细胞免受高糖损伤[6-7]。vaccarin还可激活FGF2/FGFR-1信号通路诱导新生血管的形成[8]，促进内皮细胞增殖、迁移[6]。现有的证据表明vaccarin在维护心血管功能中的重要作用。然而，有关vaccarin对动脉粥样硬化的形成以及过程中导致的巨噬细胞胞内脂质沉积的作用尚不清楚，有待进一步研究。

另外，本课题组前期研究表明， vaccarin可有效抑制内皮细胞内ROS水平[9-10]，但vaccarin对ox-LDL诱导的巨噬细胞内ROS水平以及胞内脂质沉积的影响目前尚不清楚。本实验主要研究在ox-LDL诱导巨噬细胞脂质沉积过程中，vaccarin对胞内ROS产生，p38/MAPK信号通路的活化及脂质沉积的影响。为今后动脉粥样硬化的治疗提供新的线索。

1 材料与方法

1.1 主要药品与试剂DMEM培养基(HyClone，美国，AE29170268)；ox-LDL(上海索莱宝科技有限公司，20190806)；油红O染料(上海索莱宝科技有限公司，1219D051)；DCFH-DA探针试剂盒(上海索莱宝科技有限公司，803A021)；vaccarin(上海士峰生物科技有限公司，19042671)；H2O2(Sigma，美国，323381)；N-乙酰半胱氨酸(NAC)(Sigma，美国，1724426)；SB203580(SB)(Merck，德国，559389)；anisomycin(ani)(Cell Signaling Technology，美国，931398-72-0)、p-p38MAPK(Thr180/Tyr182)抗体(Cell Signaling Technology，美国，4511)；甘油三酯(triglyceride,TG)试剂盒(南京建成生物有限公司，20171216)；胆固醇酯(cholesteryl ester,CE)试剂盒(Abcam，英国，ab65359)；p38MAPK抗体(Abcam，英国，ab31828)；β-actin抗体(Abcam，英国，ab179467)；辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)标记的羊抗兔及鼠抗体(江苏康为世纪生物科技有限公司，01334/10426及01325/20348)。

1.2 实验仪器CO2细胞恒温培养箱(Thermo，美国)；HS-840-U型超净工作台(常熟市雪科电器有限公司)；低速离心机(上海医疗器械厂)；电泳仪、湿转仪、全能型凝胶成像分析系统(Bio-Rad，美国)；蔡司全自动正置荧光显微镜(Zeiss，德国)；酶标仪(BioTek，美国)。

1.3 细胞培养将Raw 264.7细胞接种于含有10% FBS，1%青链霉素的DMEM培养基中，于37 ℃，5% CO2培养箱中培养，取对数生长期细胞进行后续处理。

1.4 实验方法

1.4.1油红O染色法检测巨噬细胞内脂质沉积情况 取生长状态良好的Raw 264.7细胞，消化处理后，以1×104个/孔接种于96孔板中。按照细胞油红O染色方法[11]进行处理，显微镜下拍照观察。

1.4.2细胞内ROS水平检测 DCFH-DA探针能够用于检测细胞内的ROS水平。在处理好的Raw 264.7细胞中加入10 μmol·L-1的DCFH-DA。 37 ℃避光孵育 30 min，用PBS清洗3遍，使用荧光显微镜拍照检测荧光强度。

1.4.3细胞内TG和CE水平检测 取生长状态良好的Raw264.7细胞，消化，计数后，以20×105个/孔均匀接种于6孔板中。按照不同的分组加入相应的试剂进行处理。24 h后，再按照试剂盒的说明书处理细胞，使用酶标仪分别在510 nm和570 nm下检测OD值，并进行分析。

1.4.4免疫印迹(Western blot)检测p38蛋白及其磷酸化表达水平 RIPA缓冲液裂解细胞后，提取细胞总蛋白，定量变性后，进行SDS-PAGE电泳，随后转移到PVDF膜上。转膜结束后用5%的脱脂牛奶封闭1 h，p38MAPK、p-p38MAPK(Thr180/Tyr182)、β-actin抗体按说明书稀释，4 ℃孵育过夜。用1×TBST充分清洗后，使用HRP标记的二抗室温孵育2 h。用1×TBST清洗后进行显影，最后使用ImageJ分析目标蛋白灰度值。

2 结果

2.1 vaccarin改善ox-LDL诱导的巨噬细胞脂质沉积通过油红O染色发现，Raw 246.7细胞经100 mg·L-1ox-LDL处理24h后，与对照组相比出现明显脂质沉积(Fig 1A)。另外，TG以及CE测定结果显示，ox-LDL处理组脂质含量明显升高(Fig 1B)。实验中发现vaccarin能够改善胞内脂质沉积，通过不同浓度的vaccarin(1、2、5、10 μmol·L-1)与ox-LDL共同处理细胞，发现与ox-LDL组相比，在vaccarin为5 μmol·L-1时能够明显降低TG和CE水平，改善胞内脂质沉积(Fig 1A，B)，故选取5 μmol·L-1vaccarin进行后续实验。

Fig 1 Effect of vaccarin on lipid deposition in Raw 264.7 induced by A.Oil red O staining of different groups; B.TG、CE levels.*P<0.05 vs control,#P<0.05 vs ox-LDL.

2.2 vaccarin抑制ox-LDL诱导的巨噬细胞ROS产生及p38/MAPK信号通路活化实验通过测定ROS水平，发现与对照组相比，ox-LDL组ROS产生增加，而vaccarin能够逆转这一效果(Fig 2A)。另外，Western blot结果发现，ox-LDL组p38蛋白磷酸化水平增加，而vaccarin能够使其表达降低(Fig 2B)。推测vaccarin能够抑制ox-LDL诱导的巨噬细胞ROS产生及 p38/MAPK信号通路活化。

Fig 2 Effect of vaccarin on ROS production and p38/MAPK in Raw 264.7 induced by A.Intracellular levels of ROS in different groups; B.Expression of protein p38 and p-p38. 1:Control; 2:ox-LDL;3:ox-LDL+Vaccarin;4:Vaccarin；*P<0.05 vs control,#P<0.05 vs ox-LDL.

2.3 vaccarin通过ROS/p38信号通路抑制ox-LDL诱导的巨噬细胞脂质沉积油红O染色以及CE检测发现，预孵ROS抑制剂NAC和p38/MAPK抑制剂SB后能够增强vaccarin对ox-LDL诱导的巨噬细胞脂质沉积的清除作用(Fig 3A，C ；Fig 3D，F)。而预孵ROS激活剂H2O2和p38/MAPK激活剂ani能够一定程度逆转这一效果(Fig 3B，C；Fig 3E，F)。综上，推测vaccarin可能通过ROS/p38信号通路抑制ox-LDL诱导的巨噬细胞脂质沉积。

Fig 3 Effect of vaccarin on lipid deposition in Raw 264.7 induced by ox-LDL through ROS/p38 signaling pathways A.Oil red O staining of different groups pre-incubated with NAC; B.Oil red O staining of different groups pre-incubated with H2O2; C.CE levels of different groups pre-incubated with NAC and H2O2; D.Oil red O staining of differentgroups pre-incubated with SB; E.Oil red O staining of different groups pre-incubated with ani; F.CE levels of different groups pre-incubated with SB and ani.*P<0.05 vs ox-LDL,#P<0.05 vs ox-LDL+Vaccarin.

2.4 p38/MAPK信号通路在 vaccarin抑制ox-LDL诱导的巨噬细胞脂质沉积中起决定作用Western blot结果显示，预孵ROS抑制剂NAC和p38/MAPK抑制剂SB后能够降低ox-LDL诱导的p38蛋白磷酸化水平，同时能够协同增强vaccarin降低p38 蛋白磷酸化水平的程度(Fig 4A，C)。另外，预孵ROS激活剂H2O2和p38/MAPK激活剂ani后能够明显增加ox-LDL诱导的p38蛋白磷酸化水平，并且逆转vaccarin对p38蛋白磷酸化的抑制效果(Fig 4B，D)。继而表明，p38/MAPK信号通路或许在vaccarin抑制ox-LDL诱导的巨噬细胞脂质沉积中起决定作用，即ox-LDL可以通过增加ROS的产生进而激活p38/MAPK信号通路从而导致巨噬细胞脂质沉积，而vaccarin可以改善这一效果。

Fig 4 Expression of protein p38 and p-p38 in Raw 264.7 A.Western blot analysis of groups incubated by NAC; B.Western blot analysis of groups incubated by H2O2; C.Western blot analysis of groups incubated by SB; D.Western blot analysis of groups incubated by ani.*P<0.05 vs ox-LDL,#P<0.05 vs ox-LDL+Vaccarin.

3 讨论

心血管系统疾病病死率目前居世界首位，远高于恶性肿瘤。动脉粥样硬化为心血管疾病发展进程中的特征性病理改变，机制非常复杂。LDL在动脉粥样硬化病程进展的各阶段均扮演重要角色[12]。起初LDL在动脉壁处聚集，受到氧化修饰后，生成ox-LDL可募集循环血液中的单核细胞，进入动脉中膜层分化成巨噬细胞[13]。动脉粥样硬化与炎症反应密切相关，其特征是动脉中脂质和纤维性物质积累。早期病变过程包括：巨噬细胞通过清道夫受体CD36等吞噬LDL以后，将其修饰为LDL-C为主的胆固醇，并且积聚成为“泡沫细胞”。本研究结果表明，ox-LDL可诱导巨噬细胞产生明显的脂质沉积，表现为细胞内甘油三酯和胆固醇酯水平均显著升高。

正常生理状态，胞内维持着氧化与抗氧化的平衡。当细胞遭遇如ox-LDL等病理因素的刺激时，胞内平衡被破坏，产生大量ROS，后续表现为多种细胞毒效应的产生[14]。本研究结果显示，ox-LDL使巨噬细胞内ROS 水平显著升高。表明ox-LDL暴露，使巨噬细胞的抗氧化能力受损，氧化应激加剧。既往研究显示，p38/MAPK信号通路的激活，致使胞内炎性相关细胞因子水平升高，进而使胞内ROS水平升高[14]。本研究中，ROS抑制剂NAC在抑制巨噬细胞胞内ROS产生后，我们观察到脂质沉积的现象有所改善，这种改善可被vaccarin进一步加强。同时ROS激活剂H2O2处理细胞后，脂质沉积情况显著加重，且这种现象可被vaccarin逆转。以上研究结果表明，oxLDL可诱导巨噬细胞内ROS水平增加，且ROS可导致胞内脂质沉积现象的发生，而vaccarin可改善ox-LDL诱导的脂质沉积。

为了进一步研究p38/MAPK信号通路的作用，本研究使用p38/MAPK特异性抑制剂SB203580，抑制通路活性。结果表明，p38/MAPK通路抑制后，可降低巨噬细胞胞内脂质沉积现象，且这种抑制作用被vaccarin进一步加强。反之，p38/MAPK特异性激活剂anisomycin能够加重胞内脂质沉积现象，而能够被vaccarin反转。另外，研究中发现，使用ROS抑制剂NAC后能够抑制p38/MAPK信号通路活性，而ROS激活剂H2O2则相反。表明ROS是p38/MAPK信号通路激活的始动因子，干预ROS水平或p38/MAPK信号通路活性，均可引起胞内脂质沉积现象的改变，而在此过程中，vaccarin起正向调节作用。

根据以上结果，可得出以下结论：ox-LDL能够诱导巨噬细胞内发生氧化应激，产生ROS。ROS能够诱导p38/MAPK信号通路激活，进而诱发巨噬细胞胞内脂质沉积的发生，而vaccarin可通过调节ROS水平和p38/MAPK信号通路活化程度，改善ox-LDL诱导的胞内脂质沉积现象。vaccarin对于ox-LDL诱导的巨噬细胞胞内脂质沉积的改善作用，为今后干预治疗提供了新的思路。