罗武龙，陈 洁，牛 婕，李 玲，曾宁溪，严 灿，吴丽丽

(广州中医药大学中西医结合基础研究中心,广东 广州 510006)

抑郁症是一种情感障碍疾病，可以由多种因素引起，高发病率和高致残率是其特点。在抑郁症的药物治疗中，存在治愈率低、复发率高等突出问题。二仙汤是中医经典名方，方中仙茅、仙灵脾可以温肾阳，补肾精；黄柏、知母滋肾阴，泻肾火；当归温润养血，调理冲任。已有研究证实，二仙汤及其加减对抑郁症具有明显的改善作用[1-2]。

网络药理学是一种以系统生物学和多向药理学为理论基础，通过网络数据库检索及计算机虚拟计算，构建“药物-成分-靶点-疾病”间网络，用于探讨药物对疾病作用机制的生物信息学新研究方法[3]。中医学理论体系的基本特点为整体观和辨证论治，与网络药理学的系统性、整体性有异曲同工之妙。网络药理学能有效推动中药复方的深入研究，揭示中药药效物质基础及分子机制。分子对接是基于受体和配体的空间结构的对接，能快速预测中药成分与靶点之间的结合力。本研究采用网络药理学与分子对接相结合的方法，探讨二仙汤抗抑郁的可能作用机制。

1 材料与方法

研究流程见Fig 1。

Fig 1 Research process of depression resistance of Erxian decoction

1.1 二仙汤中化学成分的获取在中药药理学数据库及分析系统平台中搜索，结合文献检索，筛选二仙汤中仙灵脾、仙茅、巴戟天、当归、黄柏、知母的所有化学成分。

1.2 口服生物利用度和类药性筛选中药多为口服制剂，到达靶标器官、组织发挥作用，需要经过吸收、分布、代谢、排泄，即ADME过程。通过TCMSP数据库以阈值OB≥30%，DL≥0.18(中药ADME的核心参数是口服生物利用度，OB；类药性，DL)筛选出符合条件的活性成分。当归中一些具有高含量和高生物活性，但不全部满足这两个标准的化合物，因文献报道其具有显著的药理学作用，故也将其作为当归的活性成分予以保存[4]。

1.3 二仙汤潜在靶点挖掘基于TCMSP数据库，将仙灵脾、仙茅、巴戟天、当归、黄柏、知母中的活性成分与潜在靶点逐个配对，通过UniProt数据库中的UniProtKB功能，限定物种为“human”，输入蛋白名称，得到靶点蛋白的官方名称(official gene symbol)，即为二仙汤活性成分的潜在作用靶点。

1.4 抑郁症相关靶点获取在基因疾病关联数据库DisGeNET(http://www.disgenet.org/home/)以关键词“mental depression”进行检索，得到抑郁症的治疗靶点。

1.5 二仙汤与抑郁症PPI网络构建String数据库(https://string-db.org/)可以预测蛋白质相互作用信息。利用获得的预测信息，将二仙汤靶点映射到抑郁症已知的治疗靶点的靶点上，构建蛋白质-蛋白质相互作用网络(PPI)，并利用可视化软件Cytoscape 3.6.0的“Network Analyzer”插件以节点度值(Degree)、中心性(Closeness Centrality)为拓扑指标对网络进行拓扑分析，网络中节点(node)之间若存在调控作用关系则以边(edge)相连。Degree和Closeness Centrality常用于说明网络节点的重要性，其值越大，说明该节点在网络中越重要，对该网络起主要调控作用的核心靶点以大于Degree中位数的2倍和大于Closeness Centrality中位数作为拓扑指标进行拓扑分析筛选。

1.6 GO生物学过程和KEGG信号通路分析利用DAVID(http://david.nifcrf.gov/)数据库对拓扑分析后的核心靶点进行GO生物学过程分析和KEGG通路分析，首先以P值作为筛选指标，选取P<0.01的条目，结合文献阅读筛选与抑郁症密切相关的通路，得到核心靶点参与的关键通路信息，将二仙汤对应的靶蛋白直接映射到通路上，选取既包含药物靶点又包含疾病靶点的通路。

1.7 “活性成分-靶点-通路”网络的构建为了更清晰的展现复方成分、核心靶点与通路之前的关系，将通路上所含有的活性成分及靶点，利用Cytoscape3.6.0软件构建二仙汤活性成分-靶点-通路图。在该网络中，活性成分、核心靶点或通路以节点表示；活性成分、靶点及作用通路之间的关系以边表示。

1.8 分子对接验证分子对接可以调整受体化合物的的位置、构像等，将三维结构已知的分子依次放于靶标分子的活性位点处，寻找小分子化合物与靶蛋白的最佳结合体。其结果可显示中药活性成分与重要靶蛋白之间的结合活性, 对网络药理的分析结果起到一定的验证作用。

利用Uniport检索靶点，选择高分辨率的PDBID，化合物的3D结构文件可在PubChem中下载，运用SystemsDock进行分子对接验证。PTGS2是“活性成分-靶点-通路”网络中Degree值最大的靶点，将其与对应的部分活性成分及通路中二仙汤和抑郁症共有靶点中Degree排名最靠前的两个靶点AKT1和MAPK1与各自对应的部分活性成分进行分子对接验证。

2 结果

2.1 二仙汤中活性成分及潜在靶点筛选通过TCMSP数据库检索，二仙汤中仙灵脾得到化学成分130种，仙茅78种，巴戟天174种，当归135种，黄柏140种，知母81种；根据口服生物利用度和类药性分析并结合文献报道，二仙汤共筛选出77个主要活性成分，其中仙灵脾23种、仙茅7种、巴戟天18种、当归16种、黄柏37种、知母15种。值得注意的是，谷甾醇(stigmasterol)是黄柏、知母、仙茅、当归的共有活性成分，β-谷甾醇(beta-sitosterol)是巴戟天、仙茅、当归的共有活性成分，槲皮素(quercetin)是黄柏和仙灵脾的共有活性成分，山柰酚(kaempferol)是仙灵脾和知母的共有活性成分。将筛选得到的活性成分基于TCMSP逐一配对潜在靶点，得到二仙汤的潜在靶点。其中黄柏有225个靶点，当归有94个靶点，巴戟天有60个靶点，仙灵脾有256个靶点，仙茅有55个靶点，知母有118个靶点，重复靶点仅保留1个，二仙汤共有268个潜在靶点。

2.2 精神抑郁的治疗靶点获取在DisGeNET数据库中共检索获得574个精神抑郁的已知治疗靶点。

2.3 靶蛋白PPI网络分析基于String数据库得到二仙汤268靶点和精神抑郁574靶点的蛋白互作(PPI)网络，共有713个节点和17 043条蛋白互作关系。将该PPI网络中Degree中位值的两倍即70，Closeness Centrality的中位数即0.499作为拓扑指标筛选，最后得到90个靶点，作为二仙汤发挥抗抑郁作用的核心靶点。这90个靶点包括52个来源于二仙汤的靶点，68个来源于精神抑郁的已知治疗靶点，以及30个共同来源的靶点。

2.4 GO生物过程和KEGG代谢通路富集分析将拓扑分析得到的90个靶点映射到GO生物学过程和KEGG通路上，GO生物学过程共得到644条，以P<0.01为筛选指标，选区与抑郁症相关的条目，共53条，主要涉及一氧化氮生物合成过程的正调控、ERK1的正调控、调节血压、凋亡调控等，见Fig 2。KEGG共筛选得到127条通路，首先，以P<0.01为筛选指标，得到通路106条；其次，结合已知抑郁症病理机制及文献报道，选出与抑郁症密切相关的24条通路。在这24条通路中，包括与凋亡相关的7条通路:Ras信号通路、PI3K-Akt信号通路等；与突触可塑性相关的8条通路：多巴胺能神经突触、ERBB信号通路等；3条与神经发生相关的通路:cAMP信号通路和VEGF信号通路;6条与炎症免疫相关的通路:肿瘤坏死因子信号通路和细胞因子受体相互作用信号通路等, 见Tab 1。

Tab 1 KEGG pathway analysis of potential targets of Erxian decoction in treatment of depression

Fig 2 GO biological process analysis of potential targets of Erxian decoction in treatment of depression(only top 20 are displayed)

2.5 “成分-靶点-通路”网络分析“活性成分-靶点-通路”网络图共由61个活性成分(其中八个活性成分名称较长,用阿拉伯数字1～8代替,见Tab 2)，44个靶点，24条通路共同构建，见Fig 3。其中，二仙汤与抑郁症的共有靶点有12个。以整个网络的Degree中位数的两倍即8，筛选出重要的节点。结果显示，在这个网络中，活性成分类的节点有四个具有高Degree值。槲皮素(quercetin，Degree=32)来自仙灵脾和黄柏；木犀草素(luteolin，Degree=22)来自仙灵脾；β-谷甾醇(beta-sitosterol，Degree=9)来自仙茅，巴戟天，当归，黄柏；山奈酚(kaempferol，Degree=11)来自仙灵脾和知母。靶点类的节点中有15个具有高Degree值：PTGS2(Degree=56)、ADRB2(Degree=24)、MAPK1(Degree=20)、AKT1(Degree=19)、RKCA(Degree=15)、RELA(Degree=14)、NOS3(Degree=13)、MAPK14(Degree=12)、GSK3B(Degree=11)、MAPK8(Degree=10)、TNF(Degree=10)、JUN(Degree=10)、CASP3(Degree=8)、IL6(Degree=8)、OPRM1(Degree=8)。其中除PRKCA、RELA、CASP3外，其余12个靶点均是二仙汤与抑郁症的共有靶点。通路类的节点中有13条通路具有高Degree值，其中与细胞凋亡有关的富集通路为PI3K-Akt signaling pathway(Degree=18)、MAPK signaling pathway(Degree=14)、FoxO signaling pathway(Degree=12)、Ras signaling pathway(Degree=10)、JAK-STAT signaling pathway(Degree=9)；与突触可塑性相关的ERBB signaling pathway(Degree=9)；与神经发生相关的为Neurotrophin signaling pathway(Degree=8)、cAMP signaling pathway(Degree=8)、VEGF signaling pathway(Degree=8)；与免疫相关的TNF signaling pathway(Degree=17)、Cytokine-cytokine receptor interaction(Degree=10)、Chemokine signaling pathway(Degree=8)。

Tab 2 The “ compound-target-pathway”network replaced long compound names by Arabic numerals

Fig 3 The “ compound-target-pathway”network of Erxian decoction in treatment of depression

2.6 分子对接结果结合自由能是SystemsDock 来评价配体与受体的结合稳定性的标准，得出的分值见Tab 3。一般分值大于5.25说明分子与靶点有较好的结合活性，大于7.0说明分子与靶点的结合构型具有强烈的活性[5]。从分子对接的结果看，仙茅、当归、黄柏、知母的共有活性成分豆甾醇(Stigmasterol)，仙茅、巴戟天、当归的共有活性成分β-谷甾醇(beta-sitosterol)与PTGS2的对接分数较高；二仙汤与抑郁症的共有靶点中AKT1与对应活性成分Luteolin、MAPK1与对应活性成分Luteolin对接分数较高，说明预测的靶点与活性成分具有良好的结合能力，为后续的网路分析奠定基础。

Tab 3 Molecular docking with high scores of potential targets and corresponding compounds in Erxian decoction

3 讨论

抑郁症发病机制复杂，二仙汤是上海中医药大学张伯讷教授20世纪50 年代针对围绝经期综合征研制出的方剂，主要用于治疗更年期综合征，也是治疗抑郁症的重要方，方中知母泻火而滋肾保阴，并以助心火之下降，配合壮阳药同用对阴阳俱虚于下，而又有虚火上炎的见有肾精不足和相火旺者，疗效显著，但目前对二仙汤抗抑郁症的作用机制没有系统研究。本文基于网络药理学，通过构建二仙汤“活性成分-靶点-通路”网络，对二仙汤抗抑郁的主要活性成分、重要靶点及潜在机制进行了分析。在成分-靶点-通路网络中筛选出4个二仙汤的重要活性成分，分别为槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)、山奈酚(kaempferol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)。文献报道这些活性成分与抑郁症均有明显联系。其中，quercetin具有抗氧化、抗炎、降低细胞毒性、增加5-羟色胺水平等发挥抗抑郁作用[6]；luteolin可以抑制内质网应激诱导的细胞凋亡来发挥抗抑郁作用[7]；kaempferol可抑制神经元凋亡并促进神经再生[8]；抑郁小鼠在强迫游泳实验中的不动时间可被β-sitosterol显著缩短[9]，其机制可能是增加5-HT和NE在中枢神经系统中的含量。这提示，二仙汤可能通过这些活性成分来发挥抗抑郁效应。值得注意的是，quercetin、luteolin、kaempferol均来自二仙汤的君药仙灵脾，这与中医君臣佐使理论不谋而合，突出了君药的作用。此外，beta-sitosterol来自二仙汤的仙茅、巴戟天、当归、黄柏，quercetin来自二仙汤的仙灵脾、黄柏，kaempferol来二仙汤的自仙灵脾、知母，luteolin来自二仙汤的仙灵脾。这些重要活性成分来源于二仙汤各味中药，多活性成分共同起效，表明二仙汤具有多中药、多成分协同抗抑郁效应。

通过分析成分-靶点-通路网络中Degree值筛选出15个重要的二仙汤成分靶点，其中12个是二仙汤与抑郁症的共有靶点，这提示二仙汤可能通过这些共同靶点发挥直接的抗抑郁效应。例如，Degree值大于15的靶点PTGS2、ADRB2、ADRB1与抑郁症密切相关。据文献报道，PTGS2可降低神经炎症反应来发挥抗抑郁作用[10]。ADRB2调节的差异可能是重度抑郁症治疗起效的基础[11]。此外，这些靶点均对应了多个活性成分，如PTGS2来自beta-sitosterol等52个活性成分，ADRB2来自quercetin等22个活性成分，这说明二仙汤具有多成分、多靶点协同抗抑郁的效应。

在“活性成分-靶点-通路”网络中，与抑郁症相关的24条通路共筛选出13条富集通路，且这13条通路都包括在细胞凋亡、神经再生，突触可塑性，免疫炎症中。

神经细胞受损、凋亡是抑郁症的一个重要病理机制。在细胞凋亡方面，包括4条富集信号通路:PI3K-Akt信号通路、Ras信号通路、MAPK信号通路、Fox信号通路。PI3K/Akt信号通路调控细胞生长、增殖和分化并在细胞自噬中扮演重要角色[12]，还具有保护神经细胞的作用。Akt介导Fox通路参与调控细胞凋亡及促进细胞的增殖分化，达到神经保护作用，发挥抗抑郁效应。还有研究发现，目前抗抑郁药的疗效与Ras信号通路有关[13]。Ras信号通路下游能激活MAPK等信号通路，MAPK信号通路与细胞增殖、分化、凋亡密切相关。本研究结果显示，二仙汤抗抑郁症涉及到的中药为仙灵脾、仙茅、巴戟天、当归、黄柏、知母； 涉及到的活性成分为quercetin、luteolin、kaemferol等共20个；涉及到的靶点为EGFR、IL-6、PTEN等共28个参与到这三条通路中。

突触可塑性是大脑对应激作出的各种适应性改变，突触可塑性异常会导致神经元反应适应性不良及异常。研究表明，慢性应激可降低海马突触的可塑性。与突触可塑性相关的富集通路是ERBB信号通路。NRG1-ErbB4信号通路不仅参与调控神经系统的功能，而且对突触可塑性的形成及神经递质受体的表达都具有重要影响[14]。此外，在突触可塑性中，除了ERBB信号通路这一条富集通路，还包含了5-HT、DA突触及LTD、LTP等与抑郁症密切相关的经典通路。长时程抑制(LTD)和长时程增强(LTP)和是突触可塑性的两种主要表现形式，5-HT和DA在LTD与LTD中具有关键作用。从我们的研究成果来看，二仙汤抗抑郁症涉及到的中药为仙灵脾、仙茅、巴戟天、当归、黄柏、知母； 涉及到的活性成分为luteolin、quercetin、kaempferol等共12个；涉及到的靶点为PRKCA、AKT1、EGFR等共9个参与到这条通路中。

神经发生障碍是抑郁症产生的关键病理机制。研究证实，神经发生减少的动物模型表现出类抑郁样行为。在神经发生方面，有3种富集途径:cAMP信号途径、VEGF信号途径和神经营养因子信号途径。抑郁症的发生发展与cAMP途径密切相关。研究表明，抗抑郁药物不仅可以上调受体细胞内cAMP水平，还可以增加海马细胞内蛋白kinaseA (PKA)和CREB mRNA的表达，从而促进CREB蛋白与cAMP反应元件(cAMP response element, CRE)的结合。抑郁症动物模型已经证明，BDNF表达水平降低和海马神经发生的减少与抑郁样行为同时发生，而海马神经元损伤的修复与BDNF及相关其相关传导通路如神经营养因子通路密切相关[15]。另外，有研究表明BDNF可能是通过调节与神经发生相关的因子如VEGF和糖皮质激素等间接性影响神经发生。从我们的研究结果来看，二仙汤抗抑郁症涉及到的中药为仙灵脾、仙茅、巴戟天、当归、黄柏、知母； 涉及到的活性成分luteolin、quercetin、kaempferol等共58个；涉及到的靶点为AKT1、MAPK1、MAPK14等共16个参与到这3条通路中。

免疫炎症反应是抑郁症的重要发病机制之一。研究发现，抑郁症患者存在广泛的免疫异常。在免疫炎症方面，包含三条富集通路：趋化因子信号通路、细胞因子受体相互作用信号通路、TNF信号通路。调节免疫应答生物活性的主要信号分子是细胞因子，文献报道抑郁患者血清中IL-1、IL-6、TNF-α等促炎因子的水平明显升高，抗抑郁治疗后，促炎因子恢复到正常水平[16]。趋化因子信号通路可作用于免疫炎症[17]，阻断单个趋化因子往往就能明显地抑制炎症反应。TNF信号通路与中枢神经系统的炎症密切相关。从我们的研究结果来看，二仙汤抗抑郁症涉及到的中药为仙灵脾、仙茅、巴戟天、当归、黄柏、知母； 涉及到的活性成分为luteolin、quercetin、kaempferol等共53个；涉及到的靶点为ICAM1、IL-6、TNF等共24个参与到这3条通路中。

以上分析表明，二仙汤具有多通路协同抗抑郁效应。比如，PI3K/Akt信号通路、Fox信号通路、Ras信号通路、MAPK信号通路可协同促进细胞凋亡。在这些途径中存在着许多共同靶点，能够进行信号通路对话。如AKT1，抗抑郁药物既能磷酸化AKT1，通过PI3K/Akt的下游调控靶点mTOR及Fox来发挥改善细胞凋亡的作用，同时PI3K-Akt通过调控下游mTOR又还具有调节神经元突触可塑性的调节，调控突触蛋白的合成的作用。

综上所述，二仙汤抗抑郁的活性成分包括槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇，山奈酚等；涉及的靶点包括PTGS2、ADRB2、MAPK1、AKT1、RKCA、RELA、NOS3、MAPK14、GSK3B、MAPK8、TNF、JUN、CASP3、IL-6、OPRM等；可通过PI3K-Akt信号通路等改善细胞凋亡、ERBB信号通路等调节突触可塑性、神经营养因子信号通路等促进神经再生、肿瘤坏死因子信号通路等调节免疫炎症反应发挥协同抗抑郁效应，体现了中药复方二仙汤治疗抑郁症多成分、多靶点、多通路的作用特点。本研究的不足之处在于，对网络药理学的结果只采用了分子对接进行验证。虽然分子对接可行性很强，已经逐渐深入到中药研究的各个方面，但计算机结果不能取代实验数据，最终还是需要生物实验加以验证。