陈武军

（福建省漳州市中医院，福建 漳州 363000）

喉蛾散是由黄连、黄柏、桔梗、蜜甘草、琥珀、薄荷、硼砂、煅硼砂、珍珠、冰片、甘草、青黛、山豆根等中药组方，具有清热解毒、消肿止痛的功效，适用于咽喉肿痛、口舌生疮、牙龈肿疼等痰热证。黄连、黄柏均有清热燥湿、泻火解毒功效，其主要活性成分为盐酸小檗碱等多种生物碱，具有抗病毒、抗菌消炎、降血压、降血糖、降低血清胆固醇、抗癌、抗心律失常、升白细胞、清热解毒、利胆等生理活性［1］。为更有效控制喉蛾散的质量，确保患者用药安全有效可控，本研究中采用高效液相色谱（HPLC）法对喉蛾散中黄连、黄柏所含活性成分盐酸小檗碱进行含量测定。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters e2695型高效液相色谱仪，包括紫外检测器，Empower色谱工作站（美国Waters公司）；TU-1900型紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；ME104E型电子天平（精度为万分之一），XP26型电子天平（精度为百万分之一），均购自梅特勒-托利多仪器＜上海＞有限公司；KQ-300DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率为250 W，频率为40 kHz）。

1.2 试药

盐酸小檗碱对照品（批号为110713-201212，纯度为86.7%，中国食品药品检定研究院）；喉蛾散（医院制剂，批号分别为 20190601，20190602，20190701）；乙腈为色谱纯（美国Merk公司，批号为JB085530）；磷酸为色谱纯（美国Fisher公司，批号为190900）；甲醇为分析纯（国药集团化学试剂有限公司，批号为20190910）；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Waters Xridge RShield RP18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：乙腈（A）-0.05% 磷酸溶液（B），梯度洗脱，详见表 1；柱温：30 ℃；检测波长：265 nm；流速：1 mL ／min；进样量：5 μL。在此色谱条件下，理论板数按盐酸小檗碱峰计大于11 000。

表1 流动相梯度洗脱程序表

2.2 溶液制备［2-3］

对照品溶液：取盐酸小檗碱7.18 mg，精密称定，加70%乙醇溶解并定容至50 mL，制成每1 mL含盐酸小檗碱143.60 μg的对照品母液。

供试品溶液：取样品（批号为 20190602）0.2 g，精密称定，精密加入70%乙醇25 mL，称定质量，超声处理（功率为 250 W，频率为 40 kHz）30 min，取出，放凉，用70%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

阴性对照品溶液：按喉蛾散处方和工艺制备缺黄连、黄柏阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察［4］

专属性试验：取2.2项下对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各5 μL，按拟订色谱条件进样测定。结果供试品溶液色谱中，在与盐酸小檗碱对照品相应保留时间处有吸收峰，而缺黄连、黄柏的阴性对照品溶液在对应保留时间处无吸收峰出现，阴性对照无干扰。色谱图见图1。

线性关系考察：分别精密吸取对照品母液1，3，5，7 mL，置 20，10，10，10 mL 容量瓶中，并分别用 70%乙醇溶剂并定容，摇匀，连同母液得系列对照品溶液，分别精密吸取5 μL，按拟订色谱条件进样测定，以对照品质量浓度（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y＝20 575X-2 715.7，R2＝0.999 9（n＝5）。结果表明，盐酸小檗碱质量浓度在 7.18 ～143.60 μg／mL 范围内与峰面积线性关系良好。

图1 高效液相色谱图

精密度试验：精密吸取盐酸小檗碱对照品溶液（71.80 μg ／mL）5 μL，按拟订色谱条件进样测定，连续进样6次，计算其峰面积的相对标准偏差。结果的RSD为2.14%（n＝6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批（批号为20190602）样品6份，依法制备供试品溶液，分别精密吸取5 μL，按拟订色谱条件进样测定。结果盐酸小檗碱的平均含量为0.88%，RSD为 1.87%（n＝6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液适量，分别于0，2，4，8，12，24h时按拟订色谱条件进样测定。结果的RSD为2.61%（n＝6），表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品（批号为20190602，盐酸小檗碱的含量为0.874%）6份，每份0.2 g，精密称定，分别精密加入适量盐酸小檗碱对照品，依法制备供试品溶液，分别精密吸取5 μL，按拟订色谱条件进样测定，并计算回收率。结果见表2。

表2 盐酸小檗碱加样回收试验结果（n＝6）

2.4 样品含量测定

取3批样品（批号分别为20190601，20190602，20190701），依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，用外标法计算喉蛾散中盐酸小檗碱的含量。结果见表3。

表3 3批样品中盐酸小檗碱含量测定结果（n＝3）

3 讨论

3.1 检测波长选择［5-6］

为尽可能多地采集到丰富的物质成分信息，参考2015年版《中国药典（一部）》中黄连的盐酸小檗碱、黄柏的盐酸小檗碱，甘草的甘草苷、甘草酸，苦参的苦参碱、氧化苦参碱等指标成分的检测波长，曾分别于230，265，340nm波长处进行预试验，结果甘草苷、甘草酸峰高较低，分离度差，基线噪音影响大，定量不准确。盐酸小檗碱峰高相对较高，样品干扰少，分离度好，且基线平稳，适合作为含量测定指标成分，故选择盐酸小檗碱最大吸收波长265 nm作为喉蛾散中盐酸小檗碱含量测定的紫外检测波长。

3.2 流动相选择［7-10］

曾选择乙腈-1.5%磷酸溶液、乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸溶液、甲醇-水等流动相系统进行预试验，结果显示，采用乙腈-0.05%磷酸溶液作为流动相梯度洗脱，供试品溶液中盐酸小檗碱与其他峰分离较好，故选其作为流动相。

3.3 提取溶剂选择［11-12］

在原供试品溶液制备方法基础上考察了不同提取溶剂（70%甲醇、乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇、水）对含量测定指标成分的影响，以水为溶剂进行提取时，盐酸小檗碱的含量明显降低，70%甲醇和70%乙醇的差异不大，因甲醇具有中枢神经系统毒性，故选用乙醇体系的溶剂。分别对不同比例的乙醇提取溶剂进行比较，发现70%乙醇为提取溶剂时得到的盐酸小檗碱的含量最高，故最终选择70%乙醇为提取溶剂。