李钟鸣 黄平

【摘要】肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）在全球范围内是最常见的恶性肿瘤之一，发病率及死亡率高，预后差，严重威胁着人类的健康。影响预后最主要原因包括早期诊断困难以及术后的肝癌复发转移。因此，HCC 的早期诊断以及病程监测对改善肝细胞癌患者的总体预后非常重要。循环肿瘤细胞（CTC）是由实体肿瘤脱落至外周血液循环中，与正常血细胞相比较，其标志物以及形态存在着明显差异。随着富集与鉴定技术的进步，在癌症的早期诊断、术后动态监测以及预后评估等方面具有极大的临床应用价值。本文回顾了国内外CTC 的研究进展，对其检测技术及在 HCC 患者诊断以及预后等方面的研究与临床应用等进行综述。

【关键词】：肝细胞癌;循环肿瘤细胞;富集技术

【中图分类号】R6   【文献标识码】A    【文章编号】2107-2306（2020）03-018-03

worldwide， with high morbidity and mortality and poor prognosis. The main reason for poor prognosis are difficulties in early diagnosis， common recurrence and metastasis after surgery. Therefore， early diagnosis and postoperative monitoring of HCC are particularly important to improve the overall prognosis of HCC patients. Circulating tumor cells （ CTC） from solid tumors fall off to peripheral blood circulation， and there are differences in morphology and markers compared with normal blood cells. With the advancement of enrichment and identification methods， there exists great clinical application value in early tumor diagnosis， postoperative dynamic monitoring， and prognosis evaluation. In this article， the research progress of CTCs at home and abroad was retrospectively illustrated， and their detection methods， research， and clinical applications for diagnosis， prognosis， and other aspects of HCC patients were systematically reviewed.

Key words： hepatocellular carcinoma（HCC） ;Circulating tumor cell（CTC）; Enrichment technique

肝細胞癌（ HCC）是世界上最为常见的恶性肿瘤之一，大部分患者就诊时已处于疾病的中晚期阶段，错过了手术根治的最佳治疗时机，即使可行手术治疗，术后也极容易复发转移，预后极差。肿瘤的早发现、早诊断、早治疗可以显著提高 HCC 患者的生存质量以及生存时间。AFP（甲胎蛋白）作为HCC最为经典的血清肿瘤标志物，已经在临床上得到普及和推广，但其检测的特异性以及敏感性都难以达到预期。因此，寻找特异性、敏感性高的的肿瘤标志物一直以来便是临床研究的热点。近年来由原发癌灶释放入血的循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）引起肿瘤的复发及转移成为了研究热点。组织活检等传统有创性检测方法相比，CTC的检测具有可重复性高、高效、实时等特点[1]，在肝细胞癌早期的诊断 以及预后评估、病程监测、复发转移机制的研究中成为一种很有前景的检测形式。但是CTC在人体外周血液中的含量极低，在含有大量血细胞的外周血中富集并鉴定出这一类特殊细胞的难度特别高。现在主要基于循环肿瘤细胞的物理特性或者生物学特性等从患者的外周血液富集 CTCs，将富集到的 CTCs 再通过免疫荧光标记法、流式细胞术、细胞的核质比例法、RNA 原位杂交法等进一步筛除非 CTCs。目前已经证实CTCs在前列腺癌、肺癌、乳腺癌等肿瘤血行转移过程中发挥着关键作用[2]。本文结合各类文献，就HCC中CTCs的检测技术及其临床应用研究进展作一综述。

1. CTC 概述

早在1869年，ASHWORTH[3]等便发现血液里的一种血细胞与尸检发现的肿瘤细胞极为相似，首次提出了CTC 的概念。现在将CTC 定义为：自发或因诊疗操作由实体肿瘤或转移灶里释放进入外周血液循环里的肿瘤细胞[4]。进入血液系统未被清理的循环肿瘤细胞通过迁移、粘附、互相集聚形成微小癌栓，然后一定条件下逐渐发展成为转移灶[5]。近些年，随着医学对肿瘤转移机制研究的深入，以及各种检测技术的不断更新和改进，CTC的检测技术已经取得了一些突破性的进展。部分检测技术在特异性、敏感性及稳定性等层面已经较为理想，CTC 的临床研究与应用也已取得巨大进步。

2. HCC CTC 富集鉴定

2.1 富集：

CTC在发现后的一百多年时间里，各种检测技术得到不断提高，并为进一步研究循环肿瘤细胞在HCC发生、发展过程中的具体作用机制提供了可能性。目前的检测手段主要包括基于其力学、大小、密度、迁移能力、介电性质等物理特性以及细胞表面的肿瘤相关特异性抗原的生物学特性。随着分离技术的不断涌现及临床应用，CTC的检测手段也越来越多元、高效，大致可以分为三代：第一代主要包含以特殊过滤器、梯度离心以及免疫磁芯法为代表的批量处理 CTC 的方法;第二代主要包括微流体芯片技术、流式细胞术及CanPatrolTMCTC检测技术;第三代为在第二代基础上研发的可以对一个细胞进行分离富集的液滴微流体技术，此技术可以通过微流体装置在单独的一个细胞单元里形成液滴来分选细胞，含有单个细胞的液滴可应用于对每个细胞的特征、生存预测能力的研究等，但目前仅见于肺癌的相关研究报道。近年在HCC CTC 研究中常用的检测方法有流式细胞术、CellSearchTM系统、CanPatrolTMCTC以及微流体芯片检测技术等[6]。每一种检测技术的效率有所不同，将各种检测技术的综合应用可能会提高最终的检测效能。

多种方式相结合的CTC富集方法为处理CTC检测中成本高、耗时久的弊端，微流控芯片技术作为新型检测系统应运而生。微流控芯片技术把免疫亲和性和细胞大小相结合，设计出一种可以高效分离循环肿瘤细胞的微结构单元装置，分离效率可超过90%[7]，由于微流控芯片技术富集CTC的特异性以及敏感性都较高，从而受到学者的广泛关注[8]。在微流控芯片的表面布满了可以包被特异性抗体的位点，在操作人员的精准控制下，外周血液细胞在流过芯片时，微流控芯片上的抗体便会特异性识别，并和循环肿瘤细胞表面的抗原相结合[9]。和以往常规的富集方法比较，微流控芯片具有易脱洗、回收率高、细胞破坏少且分离速度快的特点[10]，并为之后 CTC 的培养与分析提供了机会，在临床应用中有着广阔的应用前景和巨大的潜力。

2.2 鉴定

免疫荧光标记技术是在循环肿瘤细胞鉴定技术里最为常用的一种手段，荧光标记法主要基于细胞的抗原-抗体反应来识别CTCs与非CTCs细胞。所以，适合的荧光抗体或者抗体组合是鉴定技术的关键。CellSearch 系统便是使用免疫荧光标记法对循环肿瘤细胞进行鉴定，在这个系统里，通过应用一种核内染色剂（ DAPI） 来进行免疫组化的染色，其原理是将携带EpCAM抗体的磁珠耦合，并定义为CK8、CK18、CK19阳性，CD45阴性的有核细胞。但有研究发现，CTCs 在脱离原肿瘤组织进入外周血液向其余组织转移的过程中，细胞会发生EMT （上皮-间质的转化） 。但是与其余大部分类型的上皮性肿瘤不同，几乎所有的肝癌细胞都不能正常表达EpCAM，这从很大程度上限制了基于 EpCAM各项检测技术在临床上的应用。

Liu[11]等使用一种基于磁珠负性富集的技术来达到去除CD45 + 白细胞的目的，并改进了识别循环肿瘤细胞的标志 物，该研究团队应用了三种组合抗体：CPS1 （氨基甲酰磷酸合成酶-1）、CD45和ASGPR（去唾液酸糖蛋白受体）来标记肝细胞癌患者外周循环肿瘤细胞，然后应用三重免疫荧光染色处理的技术，将循环肿瘤细胞分选出来，最后在 91% （ 29 /32） 的 HCC 患者中检测到了CPS1和（ 或） ASG-PR+CTCs，而在其余类型的癌症患者外周血中均未能检测到，抗CPS1以及ASGPR单克隆抗体两者的混合物比应用单独任一抗体鉴定HCC 细胞的特异性和敏感性都明显增加。除此以外，包括DAPI 、CD45 、ASGPR、Hsp-Par1 + 、DAPI + 、CD45 - 、CK + 、pERK / Akt + 等在内的标志物抗体组合也都被用于 CTCs 的鉴定技术。

通过探针技术实现的多重RNA原位分析杂交法应用于CTCs的分型与鉴定也是常见的方法之一。其中，Canpatrol 系统便是应用这一原理[12]。Canpatrol系统针对EMT这一途径，可以同时对间质标志物（ 如 Twist、Vimentin）和上皮标志物 （ 如EpCAM、CK8、CK18、CK19）進行检测。相关研究显示，在肝细胞癌患者外周血液中，其间质型的循环肿瘤细胞会更常见于已经出现转移的肝癌患者外周血液样本里，并且间质型循环肿瘤细胞的数目越多，提示肝癌患者的预后则会越差[13]。Qi[14]等应用该系统发现，112 例 HCC 患者（ 包含早期 HCC）中有 111 例（90.18% ） CTCs 阳性; 另外，在 12 例乙型肝炎病毒感染患者中，其中有2 例乙型肝炎病毒感染患者也测到了循环肿瘤细胞，这 2 例患者在5个月内均检测到微小肝细胞癌。除去商业化的产品 Canpatrol 系统以外，Guo[15]等对肝细胞癌患者的外周血液首先应用CD45的负性富集，然后再利用 qRT-PCR 的方法对 多 标 记物 表 征 （ EpCAM、CD133、CD90 和 CK19） 的 CTCs 进行鉴定，最后发现该鉴定手段在 肝细胞癌的诊断中具有极高的特异性以及敏感性，可以作为治疗监测以及风险预测实时参考数据。

多重RNA 原位杂交法以及免疫荧光标记法是目前世界上最常用的两种循环肿瘤细胞鉴定方法，但是这两种检测技术都极其依赖所对应的标志物，也就是说，当循环肿瘤细胞标志物不同，将会直接导致循环肿瘤细胞鉴定的特异性以及敏感性出现不同。除此以外，基于细胞的核质比例法、流式细胞术等鉴定循环肿瘤细胞也都有不少文献报道。

3. HCC 外周血 CTCs 检测的临床应用

3.1 临床分期

最近研究表明，外周血液循环肿瘤细胞阳性率与肝癌病人的肿瘤分期（ BCLC 分期、TNM 分期） 呈正相关的关系，若出现肉眼血管侵犯或者肝外转移的患者体内，其循环肿瘤细胞的阳性率则会更高。Schulze[16]等应用CellSearch 系统检测 HCC 外周血发现，循环肿瘤细胞的计数与肝癌患者的甲胎蛋白水平（AFP）、微血管侵犯、巴塞罗那（BCLC）分期、总生存率等因素都密切相关。这和Sun[17]等报道结果基本一致。循环肿瘤细胞按照不同表型可以分为上皮型、混合型、间质型三种，不同表型的循环肿瘤细胞可以从不同的方面反映肝细胞癌患者的临床特征，可作为评估 HCC 患者病情的辅助指标。应用CellSearch 系统检测肝细胞癌患者外周血液循环肿瘤细胞时还发现，在很多TNM 分期提示为早期的肝

细胞癌患者的外周血液里也会检测到循环肿瘤细胞[18]。这从侧面反映 HCC早期即有可能发展为全身性疾病，仅仅只依靠目前的临床病理分期并不能如实地反映出肝细胞癌的生物学特点以及疾病的发展情况。因此，倘若能够将 CTCs 应用于日常检查，如同乳腺癌一样将循环肿瘤细胞纳入 NCCN 指南将会对肝细胞癌患者的早期诊断大有裨益，不仅如此，循环肿瘤细胞还可以监测肝癌患者的预后，进而延长患者的生存期。

3.2 诊断监测和预后随访

临床上，肝细胞癌的诊断主要依赖于血清学的检测、医学影像、病理组织活检等方法，这些方法往往对癌症的早期诊断存在一定的局限性。循环肿瘤细胞的检测仅仅只需采集少量外周血，是一项非侵入性的诊断方法，十分有利于反复获取以及实时监测。YANG [19]等采用了流式细胞术来检测HCC患者的循环肿瘤细胞，结果显示循环肿瘤细胞的阳性率可高达91.17%，且肿瘤组织越大，阳性率越高。而健康对照组以及肝硬化组均未检测出CTCs。此外，在肝细胞癌患者的治疗前后，循环肿瘤细胞的数量也有一定的变化。因此循环肿瘤细胞的检测可用于临床上的治疗监测，并辅助临床医生评估疗效和预后，并对治疗方案进行及时地修正。LI[20]等的研究结果显示，Erk 和 Akt 为表皮生长因子受体（ epidermal growth factor receptor， EGFR）的 下 游分 子 ， 磷 酸 化 后 为 pErk 及 pAkt，pErk+/pAkt-和 pErk+/pAkt+的肝癌患者在使用索拉菲尼治疗后，CTC的平均下降率为 41.3%。SUN[21]等采用 CellSearch 系统检测 87 例肝细胞癌患者的 CTC，发现 CTC≥2个/7.5 mL 的肝细胞 癌 患 者 的 复 发 率 为 87.5%， 明 显 高 于 CTC<2 个 /7.5 mL 的 肝 细 胞 癌 患者（ 15.5%，P<0.001），且 CTC≥2 个/7.5 mL 的患者的 CTC 数量与大血管的入侵情况、分化程度及 AFP水平有关。此外，获得治疗后的外周血液，循环肿瘤细胞计数的变化能够反映此次的治疗效果[22]，患者在获得治疗后（包括外科手术切除、经动脉化疗栓塞术以及靶向药物等）外周血液里循环肿瘤细胞的计数减少或着消失提示治疗效果较好;若出现循环肿瘤细胞计数无任何变化或者下降后又再次升高的患者往往提示治疗的效果欠佳甚至出现肿瘤的复发转移或者已经产生耐药。Ye[23]等研究了循环肿瘤细胞计数与乙型病毒性肝炎相关的肝细胞癌在根治性切除术后与患者预后的关系，发现术后循环肿瘤细胞计数较低的一组（≤2/5 mL）与细胞计数较高的一组（>2/5 mL）患者相对比，DFS 和 OS 均有明显的增加，表明更高的循环肿瘤细胞计数可能是肝细胞癌患者预后不良的一个独立的因素。Yu[24]等研究了肝手术切除后肝细胞癌患者循环肿瘤细胞技术的变化，结果提示在术后循环肿瘤细胞计数增加（术前的细胞数<2，术后的细胞数≥2）的HCC患者与循环肿瘤细胞计数未增加（术前 CTC<2，术后 CTC<2）的HCC患者相比较，DFS 和 OS都明显减少;术前和术后循环肿瘤细胞计数持续≥2的HCC患者预后最差，而循环肿瘤细胞计数持续<2的患者其DFS 和 OS显著增加。以上研究结果表明术后循环肿瘤细胞计数与 HCC 患者的预后明显相关。

Hao[25]等為此进行了更深一步的研究，结果提示采用了前入路肝切除术后的肝细胞癌患者与传统入路肝切除术后的患者相比较，前一组HCC患者外周血中的循环肿瘤细胞计数显著减少，并且两年复发率也明显降低，提示前入路肝切除与传统肝切除相比，前入路肝切除显著降低了术后循环肿瘤细胞的计数，并且明显改善了患者的预后。循环肿瘤细胞在肝细胞癌预后的相关性研究中已经展现出了巨大的优势和潜力，并且已使得部分HCC患者从中获益。相信随着更大样本的研究，循环肿瘤细胞的应用价值将会得到进一步验证，并且能够使得更多的HCC患者从中获益。

4.总结

综上所述，循环肿瘤细胞的应用可能为临床医生和研究人员提供个性化方案，因为 CTCs 是敏感的生物学标志物，在HCC的各个阶段，比如肿瘤的诊断与分期、疗效的监测、预后评估和个体化精准医疗方案的制定等各方面都发挥着很大的价值。然而，在临床上使用循环肿瘤细胞分析前，必须建立一种能够捕获全部循环肿瘤细胞高特异性和敏感性的方法。截至目前，大多数的研究是单中心的病例对照研究，而且样本量十分局限，今后需要进行足够样本量和长期随访的多中心前瞻性研究，以评估最合适的循环肿瘤细胞富集检测和分离鉴定方法，以便循环肿瘤细胞更好地应用用于HCC 临床分期、预后评价以及疗效评估等。

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