杨屹，黄启林，罗晨，刘立业，孙红玉*，汤礼军*

1西南交通大学医学院，成都 610003；2西部战区总医院全军普通外科中心，四川省胰腺损伤与修复重点实验室，成都 610083

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是一种以胰腺损伤和全身炎症为特征的常见外科急腹症[1]。 根据发病诱因不同，A P 可分为胆源性胰腺炎、酒精性胰腺炎和高甘油三酯性急性胰腺炎(hypertriglyceridemic acute pancreatitis，HTG-AP)等。随着经济发展和国民饮食结构的改变，我国HTG-AP 的发病率呈逐年上升的趋势[2-3]。国内一项多中心研究发现，高三酰甘油已经超过乙醇，成为胰腺炎发病的第二大诱因[4]。相较于其他原因引起的AP，HTG-AP患者更易发生系统性炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)和多器官衰竭[5-6]，具有病情易重症化的特点。本研究通过对腹腔巨噬细胞极化表型进行分析，探究了HTG-AP重症化的机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 泊洛沙姆407(Poloxamer 407，P-407)、雨蛙素购自美国Sigma-Aldrich公司；动物用异氟烷购自深圳瑞沃德生命科技有限公司；小鼠胰淀粉酶(amylase，AMY)ELISA检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；小鼠肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、IL-10微球检测(cytometric bead array，CBA)试剂盒，anti-CD16/32抗体，BB700-conjugated anti-CD11c抗体，PE-conjugated anti-F4/80抗体，Transcription Factor Buffer Set购自美国BD公司；APC-conjugated anti-CD206抗体、LIVE/DEAD™ Dead Cell Stain Kit购自美国Thermo Fisher公司。小动物麻醉机购自深圳瑞沃德生命科技有限公司；CANTO-Ⅱ流式细胞仪购自美国BD公司；全自动酶标仪购自美国Thermo Fisher公司。

1.2 动物分组及模型制备 8 周龄雄性SP F 级C57BL/6J小鼠，体重18～20 g，购自成都达硕实验动物有限公司。采用随机数字表法分为对照组、高甘油三酯血症(hypertriglyceridemia，HTG)组、AP组和HTG-AP组，每组8只，12 h昼夜交替光照，自由进食饮水。参考Pan等[7]的方法构建HTG-AP小鼠模型。HTG组和HTG-AP组小鼠隔天1次予以0.5 g/kg P-407腹腔注射诱导HTG，对照组和AP组注射等量生理盐水；28 d后AP组和HTG-AP组以雨蛙素50 μg/kg 腹腔注射，1次/h，共9次，构建AP模型，对照组和HTG组以同样方式注射等量生理盐水。最后一次注射雨蛙素12 h后，采用PBS灌洗腹腔，收集腹腔巨噬细胞；用促凝采血管收集血液标本制备血清；并留取胰腺组织标本，用于后续实验。实验过程符合单位和国家有关实验动物管理和使用的规定。

1.3 小鼠血清三酰甘油(triglyceride，TG)、总胆固醇(total cholesterol，TC)水平测定 血清标本送西部战区总医院检验科，按常规方法检测TG、TC 水平。

1.4 小鼠血清AMY水平检测 采用ELISA检测小鼠血清AMY水平，具体操作步骤严格按说明书进行，以全自动酶标仪测定450 nm波长处的OD值。

1.5 小鼠胰腺病理组织学分析 胰腺组织以4%多聚甲醛固定过夜，依次脱水、石蜡包埋、制备4 μm切片、HE染色、封片，光学显微镜观察。采用参考文献[7-8]报道的评分方法(表1)，从水肿、坏死和有核细胞浸润3个维度，由2名病理医师对组织损伤程度进行双盲评分。每张切片随机取5个视野，取其评分的平均值。

表1 胰腺损伤病理特点与评分Tab.1 Pathological characteristics and score of pancreatic injury

1.6 小鼠血清炎性因子检测 采用CBA试剂盒，通过流式细胞仪对小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平进行检测，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。用FlowCytomix Pro软件进行数据分析。

1.7 小鼠腹腔巨噬细胞提取及流式细胞术分析 小鼠麻醉后，用5 ml预冷PBS灌洗腹腔，按摩腹腔20 s后收集灌洗液[9]。经PBS洗涤后，先用anti-CD16/32抗体封闭并以LIVE/DEADTMDead Cell Stain Kit区分死/活细胞；加入PE-conjugated anti-F4/80和BB700-conjugated anti-CD11c，分别作为巨噬细胞共同表面标志和M1型巨噬细胞特异性标志；再以Transcription Factor Buffer Set破膜后加入APCconjugated anti-CD206，作为M2型巨噬细胞特异性标志。在冰上完成上述步骤后上机检测，并用Flowjo软件分析检测结果。

1.8 统计学处理 采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 小鼠血清TG、TC及AMY水平比较 P-407腹腔注射造模28 d后，对照组、HTG组、AP组、HTG-AP 组血清TG 水平(m m o l/L)分别为0.5 2±0.0 7、37.25±2.01、0.545±0.05、38.14±2.47(图1A)， 血清T C 水平(m m o l/L)分别为2.2 3±0.1 7、11.46±0.67、2.86±0.23、11.18±0.61(图1B)。HTG组、HTG-AP组小鼠血清TG和TC浓度与其余两组比较明显升高，差异具有统计学意义(P<0.01)，即HTG小鼠模型建立成功。对照组、HTG组、AP组、HTG-AP组血清AMY水平(ng/ml)分别为175.93±40.19、226.25±54.55、592.82±60.17、653.83±79.00(图1C)，经雨蛙素作用的AP组和HTG-AP组AMY水平明显高于另外两组，差异有统计学意义(P<0.01)，提示AP造模成功。

2.2 小鼠胰腺组织损伤情况及病理评分比较 胰腺组织HE染色结果如图2所示，AP组小鼠胰腺水肿明显，小叶间隙广泛增宽，小叶间隙和腺泡实质均可见单核细胞浸润，偶见小叶边缘腺泡细胞坏死；HTG-AP组胰腺实质中腺泡间隙增宽，胰腺小叶结构破坏，并有大量有核细胞浸润，小叶边缘局部坏死灶形成；对照组、HTG组胰腺无明显水肿，结构基本正常，HTG组胰腺实质可见空泡状的泡沫细胞形成。HTG-AP组小鼠胰腺组织病理评分为7.49±0.33，明显高于AP组(5.15±0.19)，差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 各组小鼠血清TG、TC和AMY水平比较Fig.1 Comparison of levels of TG, TC and AMY in each group

图2 各组小鼠胰腺组织损伤情况及病理评分Fig.2 Pancreatic tissue injury and histopathological scoring of mice in each group

2.3 小鼠血清炎性因子水平比较 CBA检测结果显示，HTG-AP组小鼠血清促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显高于AP组，抗炎因子IL-10水平明显低于AP组，差异均有统计学意义(P<0.05，图3)。

2.4 小鼠腹腔巨噬细胞极化表型比较 流式细胞术检测结果显示，小鼠腹腔灌洗液巨噬细胞标志F4/80阳性的细胞中，HTG-AP组M1型标志CD11c阳性比例(35.5%±7.1%)明显高于AP组(22.0%±2.8%)，M2型标志CD206阳性比例(7.6%±1.9%)明显低于AP组(16.5%±2.6%)，差异均有统计学意义(P<0.05，图4)。

图3 各组小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10水平比较Fig.3 Comparison of levels of TNF-α, IL-1β, IL-6 and IL-10 in each group

图4 各组小鼠腹腔巨噬细胞极化表型的流式细胞术分析Fig.4 Flow cytometry analysis of the polarization phenotype of mice peritoneal macrophages in each group

3 讨 论

HTG-AP是指在满足AP诊断的基础上，患者发病时血清TG水平＞1000 mg/dl(11.3 mmol/L)[10]。研究表明，HTG-AP患者血清TG水平与病情严重程度呈正相关，是AP病情重症化的独立危险因素[11]。因此构建稳定的TG升高动物模型对于HTG-AP发病机制研究具有重要意义。

P-407是一类高分子非离子型表面活性剂，具有毒性低、对实验动物刺激性小的特点，可以抑制TG代谢中的关键酶——脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase，LPL)和肝脂肪酶，导致TG水解速率减慢，引起血浆TG水平升高[12]。P-407诱导的TG升高具有剂量依赖性，且组内均一性好，有利于实验结果的稳定。而传统的饮食诱导高脂血症动物模型，由于动物进食量不一及造模后期实验动物长期进食高脂食物产生的厌食现象，使得实验动物TG水平常常不能达到HTG-AP的诊断标准，且不同个体间TG水平差异也较大。在本研究中，小鼠发生AP时TG水平超过正常值30倍以上(图1A)，可有效模拟HTGAP患者发病时的严重高脂血症状态。

在本研究中，HTG-AP组胰腺组织比AP组表现出更严重的组织水肿、炎性细胞浸润和腺泡细胞坏死，病理损伤评分更高(图2)。血清细胞因子检测也发现，HTG-AP组促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6等升高更为明显，而抗炎因子IL-10虽相较于对照和HTG组也有所升高，但明显低于AP组(图3)。目前普遍认为，血清TNF-α和IL-6等细胞因子与AP及其诱发的急性肺损伤严重程度密切相关[13-14]。HTG-AP组表现出更严重的胰腺组织损伤和全身炎症水平，这也与临床研究中报道的HTG-AP患者易发生重症化相符。巨噬细胞可能在这一过程中起着重要作用。

巨噬细胞是一类固有免疫细胞，具有高度的可塑性，可根据所处的微环境向经典活化巨噬细胞(classically activated macrophage)，即M1型巨噬细胞，或替代性活化巨噬细胞(alternatively activated macrophage)，即M2型巨噬细胞极化[15]。M1型巨噬细胞可释放大量炎性因子，杀死病原体并激活免疫系统；M2型巨噬细胞则主要发挥抗炎、促进伤口愈合及组织修复等作用。在AP发病时，腹腔内会产生胰腺炎相关腹水(pancreatitis associated ascitic fluids，PAAF)，其中含有细胞因子、淀粉酶、游离脂肪酸等多种物质[16]。最新研究发现，巨噬细胞吞噬并在胞内活化的胰蛋白酶可激活NF-κB信号通路，释放大量炎性因子，引发胰腺损伤和炎症反应[17]。 腹腔巨噬细胞可直接与PAAF接触，迅速激活炎症级联反应，放大炎症信号。而且，促使腹腔巨噬细胞向M2极化有助于AP病情缓解[18]。因此，腹腔巨噬细胞极化表型对于AP病情发展具有重要意义。

高脂环境下巨噬细胞受到炎症刺激时免疫应答强度增强[19]。研究表明，巨噬细胞用三酰甘油分解后的产物软脂酸干预后，在遭遇炎症刺激时会诱发更强烈的炎症反应，M1极化相关蛋白表达量显著增加[20]。高脂环境下单核巨噬细胞吞噬脂质后可激活炎症相关信号通路，导致促炎细胞因子分泌增加[21]。氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)能与巨噬细胞表面的损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)识别受体结合，刺激巨噬细胞产生炎性因子，如诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、TNF-α和单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein 1，MCP1)等，使机体持续处于炎症状态[22]。本研究同样发现，未诱发AP的HTG组小鼠血清中，促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6浓度均高于对照组(图3)， 表明HTG可改变实验动物炎症水平。此外，HTG组小鼠胰腺中出现大量巨噬细胞吞噬脂质后形成的泡沫细胞(图2)。HTG环境下血液循环中的单核巨噬细胞更多向血管外游出，向组织中浸 润[23]。胰腺腺泡细胞损伤后泄露到胞外的高迁移率族蛋白1(high mobility group box 1，HMGB1)、热休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)和双链DNA等DAMPs可有效激活巨噬细胞，促使巨噬细胞分泌多种细胞因子和趋化因子[24]。因此，高脂环境下胰腺中增多的巨噬细胞可能更高效地将包括腹腔巨噬细胞在内的其他部位免疫细胞招募到发炎的胰腺组织，加重局部组织损伤，放大炎症信号。

腹腔巨噬细胞是AP时胰腺组织中被招募的巨噬细胞的重要来源之一。研究表明，AP发生后腹腔巨噬细胞能透过胰腺包膜并浸润胰腺组织[25]。本研究通过流式细胞检测发现，相较于AP组而言，HTG-AP组腹腔巨噬细胞M1极化增多，M2极化减少(图4)。因此，浸润到胰腺组织的M1型巨噬细胞比例增加可能是HTG-AP组胰腺组织损伤更严重的原因之一。近来有研究报道HTG导致AP发病以后胰腺组织损伤修复速度放缓[26]。这可能与M2型巨噬细胞比例减少有关。

综上所述，本研究结果表明，HTG-AP小鼠具有胰腺组织损伤加重和全身炎症水平升高的特点，这可能与高脂环境下腹腔巨噬细胞极化状态的改变有关。