王晓玉，孟 楣，陈 浩，程 蕤，魏 芳

五味骨疽拔毒散是安徽中医药大学第一附属医院骨科在十余年临床实践基础上研制的医疗机构制剂品种(批准文号：皖药制字Z20090007)，处方由山药、生天南星、玄明粉、白矾、冰片五味中药组成，共奏消肿提毒之功效。临床上适用于急慢性骨髓炎、化脓性关节炎、骨结核、骨肿痛和瘀热内阻型骨性关节炎的治疗[1]。该制剂临床疗效确切，受到病人广泛好评。处方中山药外用具有利湿消肿作用；白矾研末外敷能够消肿止痛、清热解毒，治疗肿恶疮；玄明粉外用具有清热解毒消肿之用；生天南星多入丸散用，外敷能散结消肿止痛，可用治痈疽痰核肿瘤和劳损；冰片外用有清火止痛、止痒、防腐之功效。诸药入散合用，共凑清热利湿、解毒、消肿，散结止痛之功效[2]。本试验在前期研究的基础上，建立五味骨疽拔毒散的显微鉴别、薄层鉴别及含量测定方法作为该制剂的质量控制标准，从而保证该制剂临床应用的有效性和安全性。

1 材料与方法

1.1 材料 日本OLYMPUS公司的BX43型电子显微镜；德国SARTORIUS公司的BP211D型十万分之一电子天平；瑞士CAMAG公司的定量毛细管；青岛海洋化工有限公司的薄层硅胶G板；常州荣华仪器制造有限公司的HH-6型恒温水浴锅；德国西门子公司的BCD-277型电冰箱；深圳美加丽实验室装备有限公司TF-18通风橱；上海科导公司的SK3200H型超声清洗器；酸式滴定管等。安徽中医药大学第一附属医院制剂中心提供的五味骨疽拔毒散(批号：20190311、20190506、20190710)；山药、生天南星、白矾、冰片、玄明粉药材(安徽中医药大学第一附属医院草药房，由安徽中医药大学周建理教授鉴定)；薯蓣皂苷元对照品(批号111707-201402，中国食品药品鉴定研究院)；乙酸铵(分子式CH3COONH4，分析纯，含量≥98%，天津市大茂化学试剂厂)；乙二胺四乙酸二钠滴定液标准溶液(0.05 mol/L，福建厦门海标科技有限公司)；锌滴定液标准溶液(0.05 mol/L，福建厦门海标科技有限公司)；二甲酚橙(分子式C31H28N2Na4O13S，分析纯，天津市致远化学试剂有限公司)；十二水合硫酸铝钾[分子式KAl(SO4)2·12H2O，中国食品药品鉴定研究院]，三氯甲烷、甲醇等为分析纯；水为屈臣氏纯净水。

1.2 方法

1.2.1 显微鉴别

1.2.1.1 五味骨疽拔毒散中山药的显微鉴别 查阅相关文献和预实验，五味骨疽拔毒散中山药的显微鉴别中有明显的显微鉴别特征：草酸钙针晶成束存在于黏液细胞中[3]。因此，针对此鉴别特征，我们对三批五味骨疽拔毒散样品进行了显微观察。分别称取五味骨疽拔毒散三批(批号：20190311、20190506、20190710)粉末少许，备用。依据五味骨疽拔毒散处方量同比缩小称取除山药外，五味骨疽拔毒散方中其他药材，按五味骨疽拔毒散的制备工艺制备缺山药的阴性样品粉末。采用粉末制片法(现行版中国药典通则2001)，分别将少许五味骨疽拔毒散样品置载玻片上，滴加水合氯醛加热透化后，制片，置光学显微镜下观察样品粉末中山药草酸钙结晶的显微特征。

1.2.1.2 五味骨疽拔毒散中生天南星的显微鉴别 通过查阅相关文献[4]和预实验，五味骨疽拔毒散中生天南星有明显的显微鉴别特征：草酸钙针晶。因此，针对鉴别特征，我们对三批样品进行了显微观察。称取五味骨疽拔毒散三批(批号：20190311、20190506、20190710)粉末少许，备用。依据五味骨疽拔毒散处方量同比缩小称取除生天南星外的其他药材，按五味骨疽拔毒散的制备工艺制备缺天南星的阴性样品粉末。采用粉末制片法(现行版中国药典通则2001)，分别置载玻片上，滴加水合氯醛后加热透化，制片，置光学显微镜下观察样品粉末中生天南星草酸钙结晶的显微特征。

1.2.2 薄层色谱鉴别

1.2.2.1 五味骨疽拔毒散中山药的薄层色谱鉴别 取三个批号的本品粉末各1 g，分别加入20 mL的甲醇，置超声仪中，进行超声处理(30 min)，用玻璃漏斗过滤，将滤液蒸干。残渣加入1 mL的三氯甲烷-甲醇(1∶1)的混合溶液，使其溶解，作为五味骨疽拔毒散供试品溶液。取按五味骨疽拔毒散处方比例及制备工艺要求制成的不含山药的五味骨疽拔毒散阴性对照样品，同法制成阴性对照溶液[5]。取薯蓣皂苷元对照品，加甲醇制成1 mg/mL的溶液，作为薯蓣皂苷元对照品溶液。参照薄层色谱法(现行版中国药典通则0502)进行试验，吸取五味骨疽拔毒散供试品溶液、薯蓣皂苷元对照品溶液、缺山药的五味骨疽拔毒散阴性对照溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板(规格：10 cm×10 cm)上，展开剂为三氯甲烷-甲醇(20∶0.2)，静置展开，取出，室温晾干，均匀喷以10%的磷钼酸乙醇溶液，置电加热板上加热(105 ℃，5 min)。

1.2.2.2 五味骨疽拔毒散中冰片的薄层色谱鉴别[6]取三批五味骨疽拔毒散样品各2 g，分别加40 mL的石油醚(30～60 ℃)，持续振摇(5 min)，用玻璃漏斗过滤，滤液浓缩至1 mL，作为五味骨疽拔毒散供试品溶液。取按五味骨疽拔毒散处方比例及制备工艺要求制成的不含冰片的五味骨疽拔毒散阴性对照样品，同法制成缺冰片的五味骨疽拔毒散阴性对照溶液。另取冰片对照品，加入石油醚(30～60 ℃)，制成4 mg/mL的溶液，作为冰片对照品溶液。参照薄层色谱法(现行版中国药典通则0502)进行试验，吸取五味骨疽拔毒散供试品溶液、缺冰片的五味骨疽拔毒散阴性对照溶液和冰片对照品溶液各2 μL，分别点于同一块硅胶G薄层板(规格：10 cm×10 cm)上，展开剂乙酸乙酯-环己烷(3∶17)，静置展开，取出，室温晾干，均匀喷以5%的香草醛硫酸溶液，置电加热板上加热(105 ℃)，至斑点显色清晰，与冰片对照品斑点进行比较。

1.2.3 五味骨疽拔毒散中白矾含量测定[7]

1.2.3.1 溶液的配制 称取54.6 g乙酸钠，用20 mL的1 mol/L乙酸溶液进行溶解后，加水稀释到500 mL，即得乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 6.0)。称取0.2 g的二甲酚橙，加入100 mL的水，使其溶解，即得二甲酚橙指示液(本液必须临制)。

1.2.3.2 测定方法 参照现行版药典白矾项下含量测定方法及预实验，精密称取五味骨疽拔毒散2 g，加40 mL的水进行溶解后，用玻璃漏斗进行过滤，取续滤液20 mL，加入20 mL pH 6.0乙酸-乙酸铵缓冲液，精密加入25 mL的0.05 mol/L乙二胺四乙酸二钠，煮沸3～5 min，放置冷却，滴加1 mL的二甲酚橙指示液，用0.05 mol/L的锌滴定液进行滴定，直至溶液从黄色转变为红色，并滴定结果用空白试验校正(空白试验同为两份)。每1 mL的乙二胺四乙酸二钠相当于23.72 mg的十二水合硫酸铝钾。

计算公式：

V：空白消耗滴定液体积(mL)

Vn：消耗锌滴定液体积(mL)

Mn：称取样品重量(g)

F：乙二胺四乙酸二钠校正系数

1.2.3.3 专属性考察 按五味骨疽拔毒散处方比例做缺白矾的阴性样品，按 “1.2.3.2”项下测定方法取本品适量，测定三批阴性样品。

1.2.3.4 线性关系考察 分别精密称取十二水合硫酸铝钾0.1018、0.2008、0.3006、0.4006、0.5005，置于250 mL锥形瓶中，按“1.2.3.2”项下方法测定，记录消耗乙二胺四乙酸二钠滴定液的毫升数。以十二水合硫酸铝钾对照品称取量为横座标，以消耗乙二胺四乙酸二钠滴定液的毫升数为纵座标，进行回归处理。

1.2.3.5 稳定性试验 精密称定五味骨疽拔毒散(批号：20190506)5份制备供试品，按“1.2.3.2”项下测定方法，分别放置0、2、4、6、10 h后测定各不同时间点的含量。

1.2.3.6 重复性试验 取同一批号五味骨疽拔毒散(批号：20190506)6份各2 g，精密称定，按“1.2.3.2”项下测定方法测定。

1.2.3.7 加样回收率试验 精密称取6份已知白矾含量的五味骨疽拔毒散样品适量，分别精密加入十二水合硫酸铝钾对照品适量，按“1.2.3.2”项下测定方法制备五味骨疽拔毒散供试品溶液并测定。

2 结果

2.1 显微鉴别

2.1.1 五味骨疽拔毒散中山药的显微鉴别 三批五味骨疽拔毒散样品均可观察到山药草酸钙针晶，山药草酸钙针晶成束存在于黏液细胞中，长约240 μm，且缺山药的阴性对照无干扰(见图1)。

2.1.2 五味骨疽拔毒散中生天南星的显微鉴别 三批样品均可观察到生天南星草酸钙针晶，草酸钙针晶散在或成束存在于黏液细胞中，长度63～100 μm，且缺天南星的阴性对照无干扰(见图2)。

2.2 薄层色谱鉴别

2.2.1 五味骨疽拔毒散中山药的薄层色谱鉴别 五味骨疽拔毒散供试品薄层色谱中，在薯蓣皂苷元对照品色谱相应的位置上，均显现相同的深蓝色斑点，而缺山药的五味骨疽拔毒散阴性对照色谱中无相应斑点(见图3)。

2.2.2 五味骨疽拔毒散中冰片的薄层色谱鉴别 五味骨疽拔毒散供试品色谱中，在冰片对照品薄层色谱相应的位置上，均呈现相同的紫红斑点，缺冰片的五味骨疽拔毒散阴性对照无干扰(见图4)。

2.3 五味骨疽拔毒散中白矾含量测定

2.3.1 方法学考察 以十二水合硫酸铝钾对照品称取量为横座标，以消耗乙二胺四乙酸二钠滴定液的毫升数为纵座标，进行回归处理，得线性回归方程：Y=43.435X-0.453 1，r=0.999 1(n=5)，结果表明该方法在0.101 8～0.500 5 g范围内线性关系良好；五味骨疽拔毒散处方中其他药材及辅料对滴定终点无影响，该方法专属性好；稳定性试验、重复性试验的相对标准偏差(RSD)分别为0.129%、0.197%；平均回收率为98.90%，RSD为0.129%。结果表明方法均表现良好。

2.3.2 样品含量测定与含量限度的确定 取三批五味骨疽拔毒散(批号：20190311、20190506、20190710)中白矾含量分别为298.30、292.29、301.40 mg/g。

本研究建立的滴定法测定五味骨疽拔毒散处方中白矾含量三批样品(批号：20190311、20190506、20190710)中白矾的含量测定结果为292.29～301.40 mg/g，根据《中国药典》2015年版一部“白矾”项下白矾中十二水合硫酸铝钾的含量限度为99%，结合实际生产中的药材粉末间的吸附损耗及制剂过程中的损失量，因此，暂将含量测定项标准订为：本品中每g含白矾以十二水合硫酸铝钾计，不得少于200 mg。

3 讨论

3.1 定性鉴别指标的选择 本文参考《中国药典》2015年版及文献资料，综合考虑用显微鉴别方法比较方便、快捷，更适合散剂的质量控制。因此，选取五味骨疽拔毒散方中的2味药材进行显微研究。山药的显微特征是淀粉粒、草酸钙针晶、导管、筛管、纤维等。天南星的显微特征是淀粉粒、草酸钙针晶、草酸钙方晶、导管、棕色块等。两种药材虽然都含有淀粉粒和导管，但淀粉粒、导管不能作为区别两种药材的特征。由于山药中筛管、纤维不易寻找，因此山药区别与天南星的主要特征是草酸钙针晶。虽然两种药材都含有草酸钙针晶，但二者有明显差异，天南星的草酸钙针晶单个散在或成束，或成束存在于椭圆形黏液细胞中，长63～131 μm[6]；山药的草酸钙针晶成束存在于黏液细胞中，长约240 μm[6]；草酸钙针晶可作为区别二者的特征。且阴性对照无干扰，方法简单、重复性好。依法检查本品三批，均检出山药及天南星的草酸钙针晶。因此，本方法可用来作为山药及天南星的显微鉴别方法，故建议纳入五味骨疽拔毒散的质量标准草案。

3.2 含量测定指标的选择 五味骨疽拔毒散是安徽中医药大学第一附属医院骨科在较大样本的中医症候调查和预试验的基础上，以急慢性骨髓炎、骨结核、骨肿痛、化脓性关节炎为常见的疾病，其所具有的“外邪侵袭，正气不足，痰瘀互结”这一中医的基本病机，故选择具有“补脾养胃，生津益肺，解毒杀虫，燥湿止痒”之功效的组方而来，经过十余年的临床研究表明，其具有良好的消肿提毒作用。本方立论有据，组方用药合理，精确，制剂质量可控，体现了中医临床医学以辨证论治为主的优良与特色，具有较好的临床应用前景。 含量测定是中药质量控制中重要的内容[8-9]。根据国家药品监督管理局《中药制剂质量及稳定性研究技术指导原则》规定，以检测方中君臣药，贵重药和毒剧药为主的原则。五味骨疽拔毒散是由山药、白矾、玄明粉、生天南星、冰片组成，具有消肿提毒，用于急慢性骨髓炎、骨结核、骨肿痛、化脓性关节炎和瘀热内阻型骨性关节炎等症。山药为方中君药，其含有薯蓣皂苷、淀粉、蛋白质、氨基酸等多种化合物[10-11]，通过查阅文献及2015版中国药典，薯蓣皂苷是山药中重要的活性成分，具有多种药理作用，我们对其采用HPLC法进行测定，但结果表明本制剂中薯蓣皂苷成分含量过低，遂不进行后续含量测定研究。白矾为方中臣药，具有解毒杀菌，去湿止痒之功效。在白矾的含量测定方法研究中，因铝离子与乙二胺四乙酸二钠络合反应缓慢且络合后铝离子易水解，不能采取直接滴定法[7]。本研究采用返滴定法，加入过量乙二胺四乙酸二钠与金属离子充分反应后再滴定剩余乙二胺四乙酸二钠，同时为了消除酸性介质中对二甲酚橙指示剂的封闭作用，本法加入了乙酸缓冲液来进行试验。本研究结果表明，返滴定法测定方中白矾含量重复性较好，准确度高，同时操作简便，仪器简单，适用于五味骨疽拔毒散方中白矾含量的质量控制。