王超众，王萌萌，魏强，邵丙侠，陈爽，张晓雪，董巍，孙辑凯

(1.齐齐哈尔市食品药品检验检测中心，黑龙江齐齐哈尔 161005；2.齐齐哈尔市第一医院，黑龙江齐齐哈尔 161005；3.山西医科大学，太原 030604；4.齐齐哈尔医学院药学院，齐齐哈尔 161006)

蒲公英为菊科植物蒲公英(TaraxacummongolicumHand.-Mazz)、碱地蒲公英(TaraxacumborealisinenseKitam.)或同属数种植物的干燥全草，具有清热解毒、消肿散结、利尿通淋的功效[1]。蒲公英具有良好的广谱抗菌、抗自由基、抗病毒、抗感染、抗肿瘤作用[2]，临床上主要用于治疗慢性胃炎、胃溃疡、急性乳腺炎、盆腔炎、阴道炎、急性化脓性感染和泌尿系统炎症等疾病[3]。蒲公英中化学成分种类非常多，主要为黄酮类、苷类、萜类、甾醇类、酚类、有机酸等[4]。蒲公英中酚酸类化合物含量丰富，尤其是咖啡酸含量较高，也是抗菌的主要成分[5]，《中华人民共和国药典》(2015年版)采用高效液相色谱法测定其咖啡酸的含量，咖啡酸在叶、花、根中均有分布，但在根中含量明显减少[6]，叶中咖啡酸的含量为根中4～6倍[7]。蒲公英主要活性成分不仅是酚酸类，还包括黄酮类[8]，而黄酮以木犀草素及其糖苷含量较高，而目前对于蒲公英根、蒲公英叶中黄酮类成分的含量差异报道较少，并且液质联用法已成为检测中药成分的主要方法[9-10]，故笔者在本研究采用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法同时测定蒲公英根、蒲公英叶中对香豆酸、咖啡酸、木犀草素、木犀草苷4种成分含量，为进一步研究蒲公英根和叶两部位所含化学成分的差别及改进临床应用提供科学依据。报道如下。

1 仪器与材料

1.1仪器 1290 infinity II型超高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；TSQ Quantum Access型三重四级杆质谱仪(美国Thermo Fisher公司)；Sartorius BP121S电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司，感量：0.01 mg)；CQ-250超声波清洗器(上海必能信有限公司)；DFY-400高速万能粉碎机(上海比朗仪器有限公司)。

1.2材料 对香豆酸对照品(批号：MUST-18050603)、木犀草苷对照品(批号：MUST-17121210)购于成都曼思特生物科技有限公司；咖啡酸对照品(批号：110885-201703)、木犀草素对照品(批号：111520-201605)购于中国食品药品检定研究院，含量均≥99.6%；乙腈(色谱纯，天津Dikma)；甲酸(色谱纯，天津Dikma)；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。蒲公英样品经齐齐哈尔医学院孙辑凯副教授鉴定分别为东北蒲公英(TaraxacumohwianumKitam)、红梗蒲公英(TaraxacumerythopodiumKitag)、白缘蒲公英(TaraxacumplatypecidumDiels)、戟片蒲公英(TaraxacumasiaticumDahl.)的全草，红梗蒲公英采集于内蒙古莫力达瓦旗多热博热其勒村，其余品种采集于黑龙江省齐齐哈尔市。

2 方法与结果

2.1混合对照品溶液的制备 分别精密称取对香豆酸、咖啡酸、木犀草素、木犀草苷对照品适量，分别置于6个5 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解后稀释到刻度，摇匀，用甲醇继续稀释，制得浓度分别为100 μg·mL-1的对照品储备溶液。分别精密量取对照品储备溶液2 mL，置同一个100 mL量瓶中，加70%甲醇稀释至刻度，摇匀，经孔径0.22 μm微孔滤膜滤过，即得混合对照品溶液。

2.2供试品溶液的制备 精密称取蒲公英粉末(过二号筛) 0.5 g，置于50 mL 具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇30 mL，密塞，称定质量，超声(功率250 W，频率100 kHz)30 min，放冷，用70%甲醇补足失重，摇匀，经孔径0.22 μm 微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.3色谱条件 色谱柱：Dikma Endeavorsil C18柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；流动相：0.1%甲酸溶液(A)-甲醇(B)，梯度洗脱条件：0～3 min，90% A； 3～7 min，90%→30% A；7～10 min，30% A；10～11 min，30%→90% A；流速：0.2 mL·min-1；柱温：35 ℃；进样量：2 μL。

2.4质谱条件 ESI离子源，正离子扫描，多反应监测模式，干燥气温度370 ℃，鞘气流量10 Bar，辅助气流量30 Bar，点喷雾电压4 000 V，对香豆酸、咖啡酸、木犀草素、木犀草苷监测离子对分别为165.1/119.0，181.1/135.2，287.2/153.2，449.3/287.1。见图1。

2.5方法学考察

2.5.1线性关系考察 取“2.1”项下对照品储备液适量，将对照品溶液分别稀释10，20，50，100，200，1000，10 000倍，得到一系列浓度的对照品标准曲线溶液，经孔径0.22 μm 微孔滤膜滤过后按“2.3”、“2.4”项下条件，进样2 μL。以峰面积积分(Y)对浓度(X)进行线性回归，绘制标准曲线。结果表明各成分在检测浓度范围内线性关系良好，结果见表1。

1.对香豆酸；2.咖啡酸；3.木犀草素；4.木犀草苷。

表1 4种成分线性关系考察结果

2.5.2精密度实验 取“2.1”项下制备的混合对照品溶液，按“2.3” “2.4”项条件连续进样测定6次，结果对香豆酸、咖啡酸、木犀草素、木犀草苷的峰面积RSD 分别为0.56%，0.77%，0.32%，0.58%，表明仪器精密度良好。

2.5.3重复性实验 取同一批蒲公英样品，蒲公英根和叶各取6份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3” “2.4”项条件进样测定，记录各成分峰面积，计算得到蒲公英根中对香豆酸、咖啡酸、木犀草素、木犀草苷的含量RSD分别为 0.38%，0.68%，0.81%，0.50%，蒲公英叶中对香豆酸、咖啡酸、木犀草素、木犀草苷的含量RSD分别为 0.43%，0.37%，0.85%，0.57%，表明本方法重复性良好。

2.5.4稳定性实验 精密吸取“2.2”项下的蒲公英叶供试品溶液各2 μL，分别在配制后 0，2，6，10，16，24 h进样测定，记录各成分峰面积，计算得到对香豆酸、咖啡酸、木犀草素、木犀草苷的峰面积RSD分别为0.32%，0.50%，0.44%，0.71%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.5.5检测限、定量限实验 将对照品标准曲线溶液继续稀释，在选定的色谱、质谱条件下，按照信噪比3：1计算，测得对香豆酸、咖啡酸、木犀草素、木犀草苷的检测限分别为0.4，0.6，0.5，0.5 ng·mL-1；按照信噪比10：1计算，测得对香豆酸、咖啡酸、木犀草素、木犀草苷的定量限分别为1.2，1.8，1.5，1.5 ng·mL-1。

2.5.6加样回收率实验 精密称取已知含量的红梗蒲公英根约0.25 g；每种各6份，分别加入100 μg·mL-1对照品储备溶液0.01，0.1，0.02，0.025 mL；再精密称取已知含量的蒲公英叶约0.25 g，每种样品各6份，分别加入100 μg·mL-1的对照品储备溶液0.1，1.5，0.5，0.5 mL，按“2.2”项下方法分别制备供试品溶液，按“2.3”“2.4”项条件进样测定，计算得到对香豆酸、咖啡酸、木犀草素、木犀草苷在蒲公英根和叶中的平均加样回收率，结果见表2，表3。

2.6样品的含量测定 对蒲公英根样品和蒲公英叶样品分别进行含量测定，结果见表4。

3 讨论

本实验采用UPLC-MS/MS法在15 min内同时测定对香豆酸、咖啡酸、木犀草素、木犀草苷，该方法灵敏、准确、快速，可用于测定蒲公英根和叶不同部位中4个指标性成分的含量。实验比较30%，50%，70%甲醇等不同提取溶剂，发现70%甲醇提取效果最好。同时比较回流、超声提取方法，结果提取率差异无统计学意义，超声提取简便快捷，提取率高，故选择超声提取。

《中华人民共和国药典》2015年版一部中蒲公英的质量标准只规定咖啡酸的含量限度，本研究选取酚酸类活性成分对香豆酸、咖啡酸，黄酮类活性成分木犀草素、木犀草苷为指标进行含量测定，从而达到对蒲公英根与蒲公英叶质量控制的目的。通过对蒲公英根、叶中的指标性成分含量进行比较，发现不同品种蒲公英叶所含指标性含量远远高于根，且木犀草素在根中未检测到，而蒲公英中黄酮的含量以木犀草素含量最高，蒲公英的抗氧化活性就是基于其黄酮成分[11]，有文献比较野生蒲公英根、叶提取物的抗炎作用，结果表明叶的抗炎作用优于根[12]，本研究含量测定结果与文献报道一致。

表2 蒲公英根中4种成分的加样回收率实验

表3 蒲公英叶中4种成分的加样回收率实验

续表3 蒲公英叶中4种化学成分的加样回收率实验

表4 蒲公英根和叶中4种成分含量测定结果

蒲公英作为药、食同源的中草药，开发利用其资源已引起人们的重视，本研究建立了一种快速、准确、重复性好、分离度高的含量测定方法，可为蒲公英根、蒲公英叶的含量测定限度提供参考，也为评价其药用价值及其合理利用蒲公英不同部位提供理论依据。