吴佳怿，谌素素，曹育春，张勇

(1.北京大学肿瘤医院病理科，北京 100142；2.华中科技大学同济医学院附属同济医院皮肤科，武汉 430030；3.武汉友芝友生物制药有限公司，武汉 430075)

尖锐湿疣(condyloma acuminata，CA)是由人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染引发的常见性传播疾病，人类是其唯一的宿主。CA的复发仍然是目前临床治疗的难题，寻求有效防治CA复发的措施也是目前研究的热点。笔者前期研究发现小剂量环磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)可选择性地消减FoxP3+Treg细胞，而其他T细胞亚群不受影响[1-2]，表明小剂量CTX能够降低抑制性免疫细胞。笔者建立的CTX治疗CA “间歇、短程、小剂量”治疗方案(CTX 1 mg·kg-1·d-1，连续服药7 d，停3 d为一个疗程，共3～6个疗程)，经研究也能够改善CA局部细胞免疫功能，有效抑制CA疣体的生长[2]，并降低CA复发[3]。同时，该疗法费用低、毒副作用不明显。因此，小剂量CTX治疗CA具有很好的潜在临床转化价值，然而其具体作用机制值得进一步研究。

CA组织病理表现以表皮角质形成细胞(keratinocyte，KCs)及棘层增厚呈乳头瘤样增生为主，其中的表皮KCs的增殖无疑起源于表皮中的干细胞或具有干细胞性的短暂扩增细胞。笔者前期也观察到该疗法治疗后有较大比例的患者疣体缩小，甚至消退，针对其具体的分子机制，认为疣体的产生与消退与KCs的增殖及分化密切相关。基底层中表皮干细胞占基底层细胞总数1%～10%[4-5]，表皮干细胞能够增殖分化为表皮组织中的各种细胞。因此，笔者进一步研究将小剂量CTX对CA疣体的作用机制，并聚焦于其是否影响CA疣体中KCs的干细胞性及细胞终末分化能力，报道如下。

1 资料与方法

1.1临床资料与分组 以初发CA患者20例为对照组(CA组)，其中男10例，女10例，均为首次确诊的CA患者；小剂量CTX治疗CA患者8例为治疗组(CTX组)，男5例，女3例，给予CTX 1 mg·kg-1·d-1，连续服药7 d，停3 d为1个疗程，共治疗3个疗程。两组CA患者均不伴有其他性传播疾病和病毒性感染疾病，且无其他严重的系统疾病，患者近4周未用糖皮质激素或免疫抑制剂。空白对照组(NS组)10例，为泌尿外科包皮环切的男性患者，既往无不洁性交史，本人及配偶无CA等性传播病病史，且无其他严重的系统性疾病，且近4周未接受糖皮质激素或免疫抑制剂治疗。所有CA患者均为2017年3—10月就诊于华中科技大学同济医学院附属同济医院皮肤科患者，NS组为2017年5—10月就诊于同院医院泌尿外科患者，且所有患者均为成年人。

1.2仪器与试剂 兔抗人P63抗体(批号：12143-1-AP)，兔抗人整合素α6(integrin α6，ITGA6)抗体(批号：27189-1-AP)，兔抗人KRT10抗体(批号：16855-1-AP)，兔抗人Cytokeratin19抗体(批号：10712-1-AP)，均购于三鹰生物技术有限公司。

1.3实验方法 取初发CA患者、CTX治疗3个疗程后，CA患者疣体及NS组患者包皮组织，经甲醛固定、石蜡包埋、切片，采用标准免疫组化法进行染色，石蜡切片常规脱蜡，然后经柠檬酸缓冲液浸泡进行抗原修复。用3% 过氧化氢(H2O2)阻断内源性过氧化物，接着用山羊血清封闭室温孵育。然后顺序加入一抗、二抗，DAB显色，最后使用弱氨水进行返蓝，进行切片脱水和封片以便后续观察研究。

1.4结果判定标准 P63以细胞核或细胞质中出现明显的棕黄色染色颗粒或深棕褐色染色颗粒为阳性判断标准；ITGA6和K10以细胞膜或细胞质中出现明显棕黄色染色颗粒或棕褐色染色颗粒为阳性判断标准。具体结果判定方法参照文献[6]。将每张免疫组化染色切片统一在光学显微镜下放大至200倍，按照类似等距抽样的方法原则，共取视野5个，计算每一个视野中免疫组化染色为阳性的细胞占所有细胞的百分比，取平均值。将阳性细胞百分比0%～5%标记为“-”，>5%～25%标记为“+”，>25%～50%的标记为“++”，>50%标记为“+++”。统计每个等级的切片数量。

1.5统计学方法 采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，并采用秩和检验对等级资料进行差异性分析，Spearman等级相关处理用于两组变量间的相关性研究，结果认定：α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1P63的表达 P63在正常组织中主要表达于表皮基底层； CA组表皮基底层、棘层以及颗粒层中均有表达； CTX组CA组织中主要表达于表皮基底层，在棘层中也可能出现少量的阳性表达。见图1。3组P63免疫组化表达结果见表1。P63在CA组内表达最多，表达量明显高于NS组和CTX 组，均差异有统计学意义(P<0.01)。但是P63在NS组和CTX组中表达差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2ITGA6的表达 ITGA6在细胞内主要定位于细胞浆和细胞核中，其表达结果与P63表达结果相近。见图1。3组ITGA6免疫组化表达结果见表2。ITGA6在CA组内表达最多，表达量明显高于NS组，差异有统计学意义(P<0.01)。与NS组比较， CTX组ITGA6表达差异无统计学意义(P>0.05)。与CA组比较， CTX组ITGA6表达量减少，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.3K10的表达 NS组K10主要表达于除表皮基底层以外的结构中，即棘层向外，表皮基底层表达为阴性；CA组表皮基底层K10表达为阴性，且基底层向上的结构中表达量较NS组少；CTX组K10表皮基底层同样表达为阴性，但是在棘层、颗粒层及向外的结构中表达量较高。见图1。3组K10免疫组化表达情况见表3。K10在NS组内表达最多，表达量明显高于CA组和CTX组，差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。与CA组比较，CTX组K10表达量增多，差异有统计学意义(P<0.01)。

图1 3组P63、ITGA6及K10免疫组化表达

表1 3组P63免疫组化表达情况

表2 3组ITGA6免疫组化表达情况

3 讨论

CTX本身不具有药理作用，经过肝细胞微粒体酶系统的转换作用，产生结构类似于氮芥的活性代谢物而发挥作用[7-8]。本研究是在基于小剂量CTX治疗CA的疗法能使一部分CA患者疣体缩小，甚至消退现象的基础上，进一步探寻疣体中与KCs的增殖与分化相关的分子事件。CA的组织病理显示出不同程度的棘层肥厚，且棘层细胞出现明显的空泡变性(挖空细胞)，同时有基底样细胞增生，并伴有乳头瘤样增生。疣体KCs按分化程度的序列可分为表皮干细胞、短暂扩增细胞、分化细胞及终末分化细胞。由于细胞分化是一个逐渐完成的过程，致使表皮干细胞与短暂扩增细胞之间的界限不清，无论从细胞形态上，还是从干细胞的分子表达程度上，都无法辨别这两类细胞。正常位于基底层及其上方的短暂扩增细胞其实是由表皮干细胞及其不同代的子代细胞，随着扩增代数的增加，其干细胞性是一个逐渐丧失的过程，因而干细胞的标志物在KCs中的短暂扩增细胞群体中仍然存在，目前未明确绝对的表皮干细胞标记物，但可以肯定表皮干细胞存在于具有干细胞性的一群KCs中。这是本研究使用“KCs的干细胞性”这一名词的理由。

表3 3组K10免疫组化表达情况

表皮干细胞注定是从增殖走向终末分化，转录因子P63既是干细胞标志物，也是增殖标志物，二者是一体两面性。目前对于表皮干细胞标志物的研究，主要集中于整合素、转录因子P63以及角蛋白[9-12]。Mckeon及其团队证实P63可以用于识别表皮中干细胞[9]，同时也有文献证实ITGA6可以用作表皮干细胞标志物[13]。表皮干细胞的生物学使命就是从增殖走向终末分化。而对于分化成熟的KCs，已有多篇文献使用K10作为其标志物[14-16]。因此，本文拟使用P63及ITGA6标志物用作表征疣体KCs的干细胞性，使用K10标志物用作表征KCs的终末分化程度。

就干细胞性而言，结果显示在正常包皮组织KCs的P63及ITGA6主要表达于基底层，在未经小剂量CTX治疗的对照组中，P63及ITGA6表达量均较正常包皮组织增多，而且表达部位不仅局限于基底层，在靠近基底层的棘层中也存在较多阳性表达。此结果说明CA组织中KCs的干细胞性存在增强的现象。而CTX组KCs的干细胞性明显下降，阳性表达位置主要在基底层，而靠近基底层的棘层中仅有少量表达。该结果显示小剂量CTX治疗CA后存在KCs的干细胞性明显下降现象。就KCs终末分化能力的影响而言，结果显示正常包皮组织KCs的K10表达于基底层以上的表皮结构中，基底层表达为阴性；CA组K10表达量较NS组明显减少，基底层不表达，在基底层上方的KCs中，仍可见较多阴性表达的细胞组织，该结果提示CA组织中KCs的终末分化受阻。CTX组KCs的K10表达量虽然没达到正常组织水平，但有明显增加现象，提示小剂量CTX疗法可以促进疣体组织走向终末分化。

关于表皮干细胞相关标志物在尖锐湿疣组织内的表达的研究不少，大部分结果显示表皮干细胞相关标志物在CA组织内表达增多[17-18]。依据上述结果，可以得知经“小剂量CTX疗法”治疗的CA患者，疣体中KCs的干细胞性下降，终末分化的能力增强，预示该疗法能减少疣体中KCs的增殖，促进分化。

虽然上述结果为表象，但提示今后对该疗法的有效性分子机制研究的方向，既可以聚焦到对疣体中KCs的干细胞性产生影响的具体分子机制，也可以聚焦到对疣体内KCs的终末分化的具体分子机制上。该疗法有效机制的阐明为其临床转化提供理论基础。

本研究的不足之处在于样本数量偏小，需要进一步扩大样本量进行研究，提供更充分的证据加以证实这一现象。