熊鑫，黄传奇，程璐

(武汉市第一医院药学部，武汉 430022)

清血解毒合剂(制剂批准文号：鄂药制字Z20180184)是武汉市第一医院的自制制剂，具有凉血解毒的功效，用于流火丹毒、急性皮炎、皮疹。本方由地黄、野菊花、牡丹皮、黄芩、当归、甘草、赤芍、连翘、茯苓等9味中药组成，日常以黄芩苷和芍药苷为对照品的薄层鉴别作为质量检验的方法，但中药化学成分复杂，还受产地、加工、储藏、制备工艺等的影响，对于复方制剂而言单一的方法难以全面反映其质量，需要结合相应的指纹图谱研究。中药指纹图谱研究是目前国内外普遍采用的中药质量监督和管理模式，且很多复方制剂都有系统的研究以反映其质量的稳定性[1-7]。笔者在本实验拟建立清血解毒合剂的高效液相色谱(HPLC)指纹图谱研究方法，旨在为全面提高和完善清血解毒合剂的质量标准提供科学的实验依据。

1 仪器与试药

1.1仪器 Waters e2695高效液相色谱仪(Waters2489紫外检测器，四元泵，自动进样器，柱温箱)，BP211D电子天平(德国赛多利斯公司，感量：0.01 mg)。

1.2试药 没食子酸(批号：110831-201605，含量：90.8%)、原儿茶醛(批号：110810-201608，含量：99.4%)、儿茶素(批号：110877-201604，含量：99.2%)、咖啡酸(批号：110885-200102)、芍药苷(批号：110736-201842，含量：97.4%)、甘草苷(批号：111610-200604)和黄芩苷(批号：110715-201720，含量：93.5%)对照品均购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈为色谱纯(美国TEDIA公司)，磷酸为分析纯(天津市白世化工有限公司)，纯化水自制；清血解毒合剂自制(批号：18122701，19010301，19011501，19012201，19021501，19021801，19030801，19042401，19042601，19050701)。

2 方法与结果

2.1色谱条件 伊利特C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为乙腈(A)-0.05%磷酸溶液(B)，梯度洗脱(0～10 min，2%→6%A；10～15 min，6%→10%A；15～30 min，10%→20%A；30～45 min，20%→22%A；45～55 min，22%A；55～65 min，22%→25%A；65～85 min，25%→40%A；85～86 min，40%→2%A；86～90 min，2%A)[8-18]，柱温30 ℃，检测波长230 nm，流速1.0 mL·min-1，进样量10 μL。

2.2对照品溶液制备 精密称取减压干燥至恒重的没食子酸、原儿茶醛、儿茶素、咖啡酸、芍药苷、甘草苷和黄芩苷对照品适量至25 mL量瓶中，加80%甲醇溶解定容，摇匀，分别制成对照品溶液。再精密吸取各对照品溶液适量至同一量瓶中，加80%甲醇至刻度，摇匀，即得混合对照品(浓度分别为没食子酸102.5 μg·mL-1、原儿茶醛118.7 μg·mL-1、儿茶素105.3 μg·mL-1、咖啡酸117.7 μg·mL-1和芍药苷112.5 μg·mL-1、甘草苷135.5 μg·mL-1、黄芩苷151.4 μg·mL-1)。

2.3供试品溶液制备 精密移取本品5 mL至25 mL量瓶中，加80%甲醇至刻度，摇匀，以孔径0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4方法学考察

2.4.1精密度实验 将清血解毒合剂(批号：18122701)按“2.3”项方法制备供试品溶液，并按“2.1”项色谱条件连续进样，测定6次，记录共有峰保留时间和峰面积，以26号黄芩苷为参照峰，测得样品的各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均<3.00%，说明仪器的精密度良好。

2.4.2稳定性实验 将清血解毒合剂(批号：18122701)按“2.3”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件，分别于0，2，4，8，16，24 h内进样，记录共有峰保留时间和峰面积，以26号黄芩苷为参照峰，测得样品的各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均<5.00%，说明供试品室温下的稳定性良好。

2.4.3重复性实验 取相同批号(批号：18122701)的清血解毒合剂，按“2.3”项制备方法，同时平行制备样品6份，并按“2.1”项色谱条件进样，记录共有峰保留时间和峰面积，以26号黄芩苷为参照峰，测得样品的各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均<5.00%，说明该方法重复性良好。

2.5指纹图谱的建立及分析

2.5.1指纹图谱的建立 取10批清血解毒合剂，按“2.3”项方法制备样品，按“2.1”项色谱条件分别进行测定，并记录共有峰保留时间和峰面积。将10批供试品的HPLC图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2010版)软件，选择S1为参照图谱，中位数法，时间宽度为0.5，进行匹配，随即建立清血解毒合剂的指纹图谱，并生成对照色谱图R，见图1。

图1 10批清血解毒合剂HPLC指纹图谱及对照图谱

2.5.2共有峰的确定及参照峰的选择 根据10批清血解毒合剂的保留时间和峰面积计算，以及对照图谱R的参考，选取36个峰形好，保留时间和峰面积稳定的峰为清血解毒合剂的共有特征峰，且其中26号色谱峰黄芩苷分离度好，峰面积稳定，峰型好，故选黄芩苷为本制剂HPLC指纹图谱的参照峰，见图2。

图2 共有峰HPLC色谱图

2.5.3色谱峰的指认 根据分析清血解毒合剂单味药的成分，对比已知对照品，确定了指纹图谱中7个峰的成分，分别为没食子酸、原儿茶醛、儿茶素、咖啡酸、芍药苷、甘草苷和黄芩苷，见图3。

1.没食子酸；2.原儿茶醛；3.儿茶素；4.咖啡酸；5.芍药苷；6.甘草苷；7.黄芩苷。

2.5.3相似度评价 对10批清血解毒合剂采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2010版)软件进行指纹图谱分析，得到的10批样品和对照指纹图谱的相似度，见表1，且以26号黄芩苷为参照峰，计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积，见表2，3。

3 讨论

3.1波长的选择 本制剂中共9味中药，根据《中华人民共和国药典》(2015年版)药材项下含量测定的内容和部分文献参考分析总结，并结合全波长扫描的结果，选取270，250，230，220 nm作为样品的预测波长，综合观察分析，在波长230 nm处，样品的色谱峰丰富，分离度好，基线平稳且能有多个已知对照品能与样品色谱图中的峰对应上，作为指纹图谱分析，有多个特征峰及指认峰，能较好地展现样品的HPLC峰形，故选择230 nm作为清血解毒合剂指纹图谱的检测波长。

表1 10批清血解毒合剂指纹图谱相似度结果

表2 10批清血解毒合剂共有峰的相对保留时间

续表2 10批清血解毒合剂共有峰的相对保留时间

表3 10批清血解毒合剂共有峰的相对峰面积

续表3 10批清血解毒合剂共有峰的相对峰面积

3.2流动相的选择 本实验按参考文献的流动相选择甲醇-0.1%或0.05%磷酸溶液、甲醇-水、乙腈-0.1%或0.05%磷酸溶液系统来对清血解毒合剂的样品进行流动相的选择，结果显示，在乙腈-0.05%磷酸溶液的梯度下，色谱峰分离度良好，无前延或者拖尾等现象，故选择此流动相并调整梯度到样品色谱峰峰型和分离度最佳。

3.3特征峰及参照峰的选择 根据文献选取常见已知对照品在波长230 nm处与本制剂色谱峰进行比对，标出没食子酸、原儿茶醛、儿茶素、咖啡酸、芍药苷、甘草苷和黄芩苷这7个指认峰，且黄芩苷在230 nm处峰型好，保留时间稳定，峰面积大，特征性强，故选取黄芩苷为参照峰。在本制剂的色谱峰中，标出的36个特征峰，均以黄芩苷为参照峰计算相对保留时间和相对峰面积，结果良好。在共有色谱峰中，29～32这4个色谱峰在共有峰中分离度不佳，但在单独的10批色谱峰中，这四个峰分离度、相对保留时间和相对峰面积均良好。观察整个色谱峰，30～40 min这一段分离度不够好，考虑降低有机相比例或减慢流速，但效果不佳，还延长整个色谱峰的出峰时间，故选择缓慢增加有机相，在最佳的流动相比例下完成色谱图。

本实验中，10批清血解毒合剂的指纹图谱的相似度均在0.833～0.987，大部分相对峰面积和相对保留时间均在合理的范围内，表明清血解毒合剂各批次间无明显的差异，饮片质量稳定、制备工艺纯熟，且本实验建立的指纹图谱方法简单、可靠，操作重复性强，可用于清血解毒合剂的质量标准的检验。