黄蕾，刘新国，程璐，黄文涛，胡松

(武汉市第一医院药学部，武汉 430022)

黄连降脂合剂由经验效方与现代制剂技术相结合研制而成，由黄连、葛根、天麻、陈皮、法半夏、三七粉组成，组分独特，具有燥湿化痰、活血化瘀功效，用于高脂血症、动脉粥样硬化、冠心病，疗效显著，是我院长期院内经验效方，经长期用药观察，该效方对心血管疾病有较好疗效。在前期对君药黄连含量测定的基础上，笔者在本研究增加质控，进一步完善黄连降脂合剂质量标准。

1 仪器与试药

1.1仪器 ME215S型电子分析天平(Sartorius公司，感量：0.01 mg)；Essentia LC-16型高效色谱仪(日本岛津公司)；超纯水仪(上海惠分科学分析仪器有限公司)；数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；硅胶板(青海海洋化工厂分厂)。

1.2试药 黄连降脂合剂(武汉市第一医院制剂中心，批准文号：鄂药制字Z20200014，批号：2017052200，2017052300，2017052400)；葛根素对照品(批号：110752-201615，含量：95.4%)、盐酸小檗碱对照品(批号：110713-201212)、三七对照药材(批号：120941-200304)，均购自中国食品药品检定研究院。甲醇、乙腈为色谱纯(美国Fisher公司)；其他试剂为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1黄连薄层色谱鉴别

2.1.1供试品溶液的制备 取本品，摇匀，取50 mL，用三氯甲烷振摇提取2次，每次30 mL，合并三氯甲烷液，滤过，滤液蒸干，残渣加三氯甲烷1 mL使溶解，作为供试品溶液。

2.1.2对照品溶液的制备 取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每毫升含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。

2.1.3阴性溶液的的制备 取不含黄连药材的样品50 mL，按供试品溶液制备的相同方法，制成阴性对照溶液。

2.1.4鉴别 照薄层色谱法(2015年版《中华人民共和国药典》四部通则0502)实验，吸取上述两种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10：6：1：1)为展开剂，展开，取出，晾干。置紫外灯(波长365 nm)下检视[1-2]。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的黄色荧光斑点，阴性对照无相应的斑点，见图1。

1.黄连降脂合剂(17052200)；2.黄连降脂合剂(17052300)；3.黄连降脂合剂(17052400)；4.盐酸小檗碱对照品；5.缺黄连阴性对照品。

2.2三七的薄层鉴别

2.2.1供试品溶液的制备 取本品，摇匀，取80 mL，用三氯甲烷振摇提取2次，每次50 mL，弃去三氯甲烷液，水液用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次50 mL，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次50 mL，再用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次50 mL，弃去水洗液，正丁醇液蒸至近干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。

2.2.2对照品溶液的制备 取三七对照药材1.0 g，加水5 mL润湿，与“2.2.1”项自“用水饱和的正丁醇振摇提取2次”起，同法制成对照药材溶液。

2.2.3阴性溶液的制备 取不含三七药材的样品80 mL，按供试品溶液制备的相同方法，制成阴性对照溶液。

2.2.4鉴别 照薄层色谱法(2015年版《中华人民共和国药典》四部通则0502)实验，吸取供试品溶液、对照药材溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13：7：2)10 ℃以下放置分层的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干。喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，日光下显相同颜色的斑点[3-4]。阴性对照无相应的斑点，见图2。

1.黄连降脂合剂(17052200)；2.黄连降脂合剂(17052300)；3.黄连降脂合剂(17052400)；4.三七对照药材；5.缺三七阴性对照品。

2.3黄连降脂合剂中葛根素的含量测定

2.3.1色谱条件 《中华人民共和国药典》2015年版一部关于“葛根”项下药材的含量测定方法，笔者对流动相比例进行筛选，比较改变流动相比例后，根据色谱峰的变化，最终确定色谱条件，色谱柱：C18分析柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：甲醇-水(25：75)，检测波长：250 nm，流速：1.0 mL·min-1，柱温：30 ℃，进样：10 μL，理论板数按葛根素峰计算应不低于2000。在此条件下，样品中葛根素与其他组分能够达到基线分离，与相邻的色谱峰分离度>1.5，葛根素的理论板数>5000[5-7]。

2.3.2对照品溶液的制备 精密称取葛根素14.23，14.70 mg，分别置10 mL量瓶中，加30%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液，再精密量取1 mL，分别置20 mL量瓶中，加30%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

2.3.3供试品溶液的制备 取本品(批号：17052200)，摇匀，精密量取1 mL，置100 mL量瓶中，加30%乙醇稀释至刻度，摇匀，经孔径0.45 μm滤网滤过，取续滤液即得。

2.3.4阴性溶液的制备 按处方量称取除葛根以外其余5味药材，加水10倍量，浸泡1.5 h，煎煮提取2次，每次1 h，滤过，合并滤液，将滤液加热浓缩至相对密度为1.04～1.08(40 ℃)。称取苯甲酸钠0.6 g，加水10 mL煮沸使溶解，加入上述浓缩液中，以纯化水调整全量至200 mL，摇匀，滤过，按“2.3.3”项葛根供试品溶液制法制备即得。

2.4方法学考察

2.4.1专属性实验 在选定的色谱条件下，分别取对照品溶液、供试品溶液和阴性溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪测定，结果供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，有相同保留的色谱峰，而阴性溶液在此保留时间无干扰，见图3。

2.4.2线性关系实验 精密称取葛根素14.23 mg，置于10 mL量瓶中，加30%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液(1.36 mg·mL-1)，分别精密移取此储备液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，置10 mL量瓶中，加30%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，在上述色谱条件下分别进样10 μL，分别进样2次，测定峰面积，计算平均峰面积，以平均峰面积、对照品含量计算线性回归方程：Y=5 239 190.5X-17 542.4，r=0.999 9；表明葛根素在27.15～135.75 μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.4.3精密度实验 取葛根素对照品溶液，摇匀，滤过，取续滤液即得，进样10 μL，连续进样6次，记录峰面积，结果RSD为0.04%。

2.4.4稳定性实验 取黄连降脂合剂样品(批号：17052200)摇匀，精密量取1 mL，置100 mL量瓶中，加30%乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得。分别于0，2，4，8，12，24 h进样10 μL，记录峰面积，结果RSD为1.05%，表明溶液在24 h内稳定。

A.阴性样品；B.对照品；C.供试品；1.葛根素。

2.4.5重复性实验 取黄连降脂合剂样品(批号：17052200)6瓶，摇匀，分别精密量取1 mL，分别置于100 mL量瓶中，加30%乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得，分别进样10 μL，按上述色谱条件测定葛根素的平均含量为6.99 mg·mL-1，RSD为1.47%。

2.4.6回收率实验 取已知含量样品(批号：17052200)6份，摇匀，精密量取0.5 mL，分别置于100 mL量瓶中，精密称取葛根素35.58 mg，置10 mL量瓶中，加30%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液，精密移取此储备液1.0 mL，分别置100 mL量瓶中，加30%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得，分别进样10 μL，按上述色谱条件测定含量，计算回收率，结果平均回收率为97.00%，RSD为1.62%，见表1。

表1 黄连降脂合剂加样回收率实验结果

2.4.7耐用性实验 取本品(批号：17052200)，摇匀，分别精密量取1 mL，分别置于100 mL量瓶中，加30%乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得，分别进样10 μL，在3根不同的色谱柱上测定葛根素的含量，结果表明葛根素在3根不同的色谱柱上测定结果无明显差异，见表2。

表2 不同色谱柱测定葛根素含量结果

2.5样品测定结果 取不同批次的黄连降脂合剂样品各1 mL，按“2.3.3”方法制备供试品溶液，分别吸取供试品溶液和对照品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录峰面积，按外标法计算含量，平均含量为7.01 mg·mL-1，最低浓度为6.51 mg·mL-1，综合平均浓度和最低含量批次基础上，下浮30%，暂拟定本品的含量限度为每毫升含葛根以葛根素(C21H20O9)计，不得少于4.56 mg，结果见表3。

表3 3批黄连降脂合剂样品含量测定结果

3 讨论

3.1含量测定指标的选择 为体现中药制剂在中医理论指导下的组方配伍原理，制剂质量标志物的确定应遵循组方配伍，以君药为主，臣、佐、使药兼顾的原则[8]。黄连降脂合剂处方中君药黄连应作为含量测定的指标性成分，前期对君药黄连相关成分进行含量测定，结果显示黄连中主要成分转移率分别为：表小檗碱12.96%、黄连碱10.64%、巴马汀15.67%、小檗碱13.77%，表明水提方法对黄连生物碱类提取效率较低，这些在水中溶解性较差的成分难以成为全方水提效果的衡量指标，因此未予采用。葛根作为臣药在处方中用量最大(42.25%)，用HPLC法测定其中所含有效成分葛根素含量的方法成熟准确，参考有关文献，拟定用HPLC法对葛根素进行含量测定，并进行方法学研究及3批供试品的含量测定，结果表明葛根素在27.15～135.75 mg·mL-1范围内线性关系良好，3批样品含量测定结果均在拟定的含量限度内，证明该方法稳定可行，故将该指标收载入含量测定项下。

3.2薄层色谱鉴别的选择 对黄连降脂合剂除葛根以外的药味，逐一分析薄层色谱鉴别。黄连以盐酸小檗碱对照品，进行薄层色谱鉴别，分离效果较好，供试品与对照品在相应的位置上显相同颜色的黄色荧光斑点，阴性对照无干扰，方法可行，故纳入质量标准。三七以三七对照药材进行薄层色谱鉴别，分离效果较好，供试品色谱与对照药材在相应的位置上显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰，方法可行，故纳入质量标准。天麻以天麻素对照品进行薄层色谱鉴别，与对照品色谱相应的位置上，主斑点不明显，且与其他斑点未分离，阴性对照有干扰，方法不可行，故未纳入质量标准。甘草主要化学成分为甘草甜素、甘草次酸、甘草苷等，法半夏在2015年版《中华人民共和国药典》中鉴别成分为甘草次酸，二者所含成分相互干扰，因此甘草、法半夏两味药材的薄层色谱未纳入质量标准。