倪国龙 张梓轩 焦凤萍 林国亮

山东第一医科大学(山东省医学科学院)公共卫生学院，山东 泰安 271016

原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是常见的恶性肿瘤，其恶性程度高、治愈率低，病死率高达90%[1]。目前，HCC治疗的首选方法仍是手术切除，但患者术后的复发率高，生存率也很低[2]。近年来，发现真菌多糖可以提高机体免疫力，并具有一定的抗肿瘤活性。

细胞凋亡是由基因控制的细胞自主、有序的死亡，涉及一系列基因的激活、表达以及调控等作用。目前认为恶性肿瘤与细胞周期紊乱导致肿瘤细胞无限增生和凋亡减少有关。因此，抑制肿瘤细胞增生和诱导肿瘤细胞凋亡可能成为治疗肿瘤的有效方法。Wnt信号通路由Wnt蛋白、Wnt蛋白受体和β-catenin等组成，Wnt/β-catenin信号通路与多种疾病密切相关，如可参与早期胚胎发育过程中脑和神经系统的形成、参与造血干细胞的自我更新、维持小肠组织的稳定性、调节骨密度及脂肪细胞的分化等[3]。 Wnt/β-catenin信号通路还可通过激活下游的Cyclin D1和c-myc等影响细胞的增殖和凋亡过程，从而可能和肿瘤的发生发展密切相关[4]。

本实验采用MTT法检测香菇菌糠多糖(polysaccharide extracted fromL.edodeswaste material，PLWM)对HepG2细胞增殖的影响,通过细胞形态观察香菇菌糠多糖对HepG2细胞凋亡的影响，采用Western blot检测香菇菌糠多糖对Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达的影响，探索香菇菌糠多糖是否可通过Wnt/β-catenin信号通路促进HepG2细胞凋亡而可能发挥抗肿瘤作用，为开发抗肝癌辅助药物提供实验和理论依据。

1 资料与方法

1.1 材料

香菇菌糠多糖由山东农业大学贾乐教授提供。细胞及培养基：HepG2细胞为本实验室保存，1%青霉素链霉素(1%PS)、DMEM培养基和胎牛血清FBS购自泰安联星科技有限公司。主要试剂：MTT等试剂购自泰安华鹏生物科技有限公司，β-catenin、Caspase-3、Bcl-2和GAPDH等抗体购自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1香菇菌糠多糖溶液配制 称取香菇菌糠多糖粉末10 g,加入预热的20 mL双蒸水(约75℃左右)溶解1 h。室温3 000 r/min离心15 min，轻轻吸上清，分别用0.45 μm和0.22 μm的滤膜过滤除菌。采用硫酸苯酚法测定多糖溶液的浓度，多糖溶液分成小包装保存于-20 ℃冰箱中。

1.2.2细胞培养 HepG2细胞使用DMEM(10%FBS,1%PS)培养基，在5%CO2、37 ℃培养，0.25%胰酶消化进行传代，3～4天传代1次。

1.2.3MTT实验检测香菇菌糠多糖对细胞的毒性 将HepG2细胞铺至96孔细胞培养板，5×103个细胞/孔，过夜培养。加入香菇菌糠多糖溶液，终浓度为：6.25、12.5、25、50、100和200 μg/mL，每个浓度梯度各设3个复孔。继续培养48 h后,用预温的PBS清洗细胞2次，再按上述终浓度加入香菇菌糠多糖，继续培养72 h后，向细胞培养孔中加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，继续培养4 h，弃去上清后，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150 μL，避光、室温震荡10 min。酶标仪测定各孔的吸光度(A490 nm)。

1.2.4MTT法检测香菇菌糠多糖对HepG2细胞增殖的抑制情况 将HepG2细胞接种于96孔细胞培养板，每孔细胞约2×104个，培养18～24 h后加入香菇菌糠多糖溶液，使其终浓度为50 μg/mL，同时以细胞培养液为阴性对照，每组6个复孔。在24、48、72、96和120 h后分别加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，继续培养4 h，弃去上清后，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150 μL，避光、室温震荡10 min。酶标仪测定各孔的吸光度(A490)，并依据公式：细胞存活率(%)=A给药/A对照×100%计算细胞的存活率。

1.2.5细胞形态观察香菇菌糠多糖对细胞凋亡的影响 将HepG2细胞分别以每孔1×103个接种于96孔细胞培养板，培养过夜。加入香菇菌糠多糖溶液，终浓度为50 μg/mL，以细胞培养液为阴性对照组，以DOX(10 μmol/L)为阳性对照组。培养72 h后观察细胞形态，以判断香菇菌糠多糖是否可促进HepG2细胞发生凋亡。

1.2.6Western blot检测蛋白的表达 将HepG2细胞按每孔2×105个接种于12孔细胞培养板，培养18 h后，加入香菇菌糠多糖溶液，使其终浓度为50 μg/mL，培养液为阴性对照。继续培养24 h后,采用4 ℃预冷的PBS洗涤3次，收集细胞沉淀，提取蛋白并采用BCA法测定蛋白质的浓度。配制胶板，每孔上样量为40 μg，采用10%SDS聚丙烯酰胺凝胶进行蛋白电泳，转膜，室温下5%脱脂奶粉封闭2 h，1∶1 000稀释的一抗，4 ℃孵育过夜，洗涤后换HRP标记1∶5 000稀释的二抗，室温孵育2 h。PBST洗涤3次，每次10 min。化学发光成像仪显影，检测β-catenin、Caspase-3和Bcl-2蛋白的表达，以GAPDH为内参。

1.3 统计学处理

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，剂量依赖效应采用线性回归分析方法，MTT法检测细胞增殖实验的组间比较采用单因素重复测量的方差分析，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 香菇菌糠多糖对HepG2细胞的毒性检测

表1 药物浓度与吸光度指数分布拟合回归分析

图1 香菇菌糠多糖对HepG2细胞的毒性检测

2.2 香菇菌糠多糖对细胞增殖的抑制作用

采用MTT法检测香菇菌糠多糖(PLWM)对HepG2细胞的增殖抑制作用，对时间效应(F=56.664,P<0.001)，组间比较(F=572.991,P<0.001)，两因素的交互作用(F=39.150，P<0.001)的统计分析结果显示50 μg/mL的香菇菌糠多糖具有明显抑制细胞增殖的作用，见表2，图2。

表2 阴性对照组与50 μg/mL的香菇菌糠多糖处理组数据的重复测量分析

图2 香菇菌糠多糖抑制HepG2细胞增殖的作用

2.3 香菇菌糠多糖对HepG2细胞的影响

我们也观察了香菇菌糠多糖对HepG2细胞的影响，结果发现与阴性对照组相比，50 μg/mL香菇菌糠多糖可使HepG2细胞发生明显皱缩，细胞皱缩形态与10 μmol/L DOX处理组相似，见图3，表明香菇菌糠多糖可能具有促进HepG2细胞发生凋亡的作用。

图3 香菇菌糠多糖对HepG2细胞形态的影响(×100)

2.4 香菇菌糠多糖对Wnt/βcatenin信号通路相关蛋白的影响

我们采用Western blot检测香菇菌糠多糖对Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin、Caspase-3和Bcl-2表达的影响。在HepG2细胞中，香菇菌糠多糖可明显抑制β-catenin、Caspase-3和Bcl-2的蛋白表达量，见图4。结果表明香菇菌糠多糖可能会通过Wnt/β-catenin信号通路及其下游的Bcl-2促进HepG2细胞发生凋亡。

图4 Western blot检测香菇菌糠多糖对Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的影响

3 讨 论

Wnt/β-catenin是Wnt信号通路中的经典通路，它参与了多种细胞的生命活动，包括组织器官的再生、细胞增殖、细胞凋亡和坏死等，并且Wnt/β-catenin信号通路的异常激活与多种肿瘤的发生发展密切相关[5]。

真菌多糖作为药物研究始于上世纪中期，通过多种机制发挥抗肿瘤作用。陈瑾歆等[6]发现黄芪多糖可通过抑制Bcl-2表达而促进HepG2细胞发生凋亡，吕君等[7]也发现黄芪多糖可通过下调Wnt/β-catenin信号通路下游Bcl-2的表达促进HepG2细胞凋亡。灵芝多糖可通过Erk信号途径抑制肿瘤细胞增殖[8]，香菇多糖也可通过激活T细胞和自然杀伤细胞等活性及增强免疫细胞的吞噬能力发挥抗肿瘤作用[9]，枸杞多糖能明显促进淋巴细胞分泌IL-1、IL-2，巨噬细胞释放TNF等细胞因子，激活肿瘤细胞的免疫应答[10]。

目前已有香菇多糖片用作慢性乙型肝炎和消化道肿瘤的放、化疗辅助药。我们前期研究也发现香菇菌糠多糖具有抗HBV的作用[11]。为进一步开发利用香菇菌糠多糖，发挥其药用价值，本项目通过体外细胞学实验发现50 μg/mL的香菇菌糠多糖具有明显的抑制细胞增殖作用，可使HepG2细胞形态发生明显皱缩，说明香菇菌糠多糖可能通过促进HepG2细胞凋亡而发挥抑制HepG2细胞增殖的作用。同时我们通过Western blot方法检测香菇菌糠多糖对Wnt/β-catenin信号通路及其下游分子的影响，发现香菇菌糠多糖可抑制β-catenin、Caspase-3和Bcl-2蛋白的表达量，表明香菇菌糠多糖可能通过Wnt/β-catenin信号通路及其下游的Bcl-2来促进HepG2细胞凋亡，从而起到抗肿瘤的作用。