彭书旺，陈露阳

（湖南中医药大学第一附属医院 胃肠甲状腺血管外科，湖南 长沙 410007）

甲状腺癌是最常见的恶性肿瘤之一，居恶性肿瘤发病率的第7位，在女性中居第4位，是增长最快的恶性肿瘤之一[1-3]。甲状腺癌术后预后较好，但仍有约30%患者出现复发转移，因此探索甲状腺癌复发转移的机制具有重要意义[4-5]。MIR31HG 在不同癌症中作用不同，YANG 等[6]发现MIR31HG 在胰腺导管癌中发挥促癌作用。而YAN 等[7]发现MIR31HG 在肝细胞癌中发挥抑癌作用。目前尚未有研究报道MIR31HG在甲状腺癌中的作用。本研究拟通过临床资料分析及体外实验研究MIR31HG 在甲状腺癌中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

选取2018年8月—2019年4月在湖南省中医药大学第一附属医院行甲状腺癌根治术的48例患者的新鲜癌组织及癌旁组织标本，男女各24例。人永生化正常甲状腺细胞系Nthy-ori 3-1、人甲状腺乳头状癌（papillary carcinoma of thyroid,PTC）细胞系TPC-1、K1及BCPAP 由湖南省中医药大学基础医学院实验室馈赠，Trizol RNA 提取试剂、RNA 保护液及转染试剂Lipofectamine 2000 均购自美国Thermo Fisher公司，RNA 逆转录试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，qRT-PCR 试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司，BCA 法蛋白浓度检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，PTEN 抗体（ab32199）购自美国Abcam公司，pan-Akt 抗体（#4685）、p-Akt（Ser473）抗体（#4060）购自美国Cell Signaling Technology公司，内参GAPDH（10494-1-AP）抗体、鼠二抗及兔二抗购自美国Proteintech公司，RPMI 1640 无血清培养基及FBS 购自以色列Biological Industries公司，lncRNA MIR31HG 小干扰RNA 序列及对照序列由广州锐博生物技术有限公司合成，lncRNA MIR31HG 引物及内参Actin 引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 数据库分析笔者利用GEPIA 在线数据库（http://gepia.cancer-pku.cn）分析lncRNA MIR31HG 在各种癌症及甲状腺癌中的表达。其数据主要来源于TCGA和GTEx project数据库。

1.2.2 RNA提取选取患者癌组织及癌旁组织标本，并剪成1 mm×1 mm×1 mm 小块放入RNA 保护液中防止RNA 降解，标本立即放入液氮冷冻保存，选取患者组织标本提取RNA，提取前先液氮预冷研钵，在研钵中将组织磨成粉末，加入Trizol RNA 提取试剂裂解细胞，参照Trizol 说明书分步提取组织RNA，并测定RNA浓度，选取OD260/OD280 在1.9～2.1的RNA进行后续实验，保证RNA的完整性，参照逆转录试剂盒说明书将RNA 逆转录合成cDNA，细胞样本RNA提取方法同上，提取的RNA 置于-80℃保存。

1.2.3 qRT-PCR采用常规Trizol 法分别提取癌组织、癌旁组织样本和Nthy-ori 3-1、TPC-1、K1及BCPAP 细胞系总RNA，参照逆转录试剂盒说明书将RNA 逆转录成cDNA，参照qRT-PCR 试剂盒说明书采用qPCR 二步法进行实验，反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性10 s，60℃退火及延伸30 s，共计40个循环。利用β-actin作为内参，采用2-△△Ct法计算lncRNA MIR31HG 在不同样本中的相对表达量。lncRNA MIR31HG 正向引物：5'-TATATCAGCATCCACAACCT-3'，长度20 bp；反向引物：5'-GCCAACCAACAAGCATTA-3'，长度18 bp；β-actin正向引物：5'-TGCGTGACA TTAAGGAGAA-3'，长度19 bp；反向引物：5'-AAGGAA GGCTGGAAGAGT-3'，长度18 bp。将癌旁组织样本或Nthy-ori 3-1 细胞系相对表达量设为1，计算癌组织、TPC-1、K1及BCPAP 中lncRNAMIR31HG表达情况，实验重复3次，取平均值。

1.2.4 细胞培养将Nthy-ori 3-1、TPC-1、K1及BCPAP 细胞系培养于含10% FBS、1% 100μg/ml 青霉素及100μg/ml 链霉素的RPMI 1640完全培养基中，置于37℃、5%二氧化碳细胞培养箱中培养。

1.2.5 细胞转染及分组将TPC-1 细胞胰酶消化并接种于6孔板内，待第2天细胞融合度为70%～90%，参照Lipofectamine 2000 Transfecon Reagent 说明书，转染3条lncRNA MIR31HG siRNA作为实验组，分别为siRNA-1、siRNA-2及siRNA-3组。将作为对照的siRNA-NC组转染24 h后，提取细胞RNA 样本，qRT-PCR 验证lncRNA MIR31HG的抑制效率，保证lncRNA MIR31HG 抑制率＞60%，用于后续实验研究。lncRNA MIR31HG siRNA-1（序列：5'-UUCAACUUCUCACACAAAGCG-3'，屏蔽序列位置为751～773，共22个核苷酸）、siRNA-2（序列：5'-UCAACUUCUCACACAAAGCGC-3'，屏蔽序列位置为784～806，共22个核苷酸）、siRNA-3（序列：5'-AAAAGCAUCCUGAUUUCUCAA-3'，屏蔽序列位置为1 032～1 054，共22个核苷酸）及相应阴性对照序列3条siRNA 均可以靶向lncRNA MIR31HG的4个转录本（Accession Number为NR_027054.2、NR_152877.1、NR_152878.1和NR_152879.1）。

1.2.6 MTT检测细胞增殖能力TPC-1 细胞转染lncRNA MIR31HG 小干扰RNA siRNA-1、siRNA-3及阴性对照序列24 h后，收集对数期生长的实验组及siRNA-NC组细胞，调整细胞浓度，取100μl 接种于96孔板，保证每孔约2 000个细胞（5×105个/ml），分别于培养0、24、48、72及96 h后更换培养基，每孔100μl，向每孔加入10μl MTT 工作液，继续培养4 h，小心吸掉上清，每孔加入100μl 二甲基亚砜37℃孵育10 min，使结晶物充分溶解。在570 nm 波长处利用酶标仪测定各孔OD值，实验重复3次，取平均值并绘制增殖曲线。

1.2.7 划痕实验检测细胞迁移能力预先用Marker笔在6孔板背后每隔0.5 cm 划一道横线。培养各组细胞至对数期，按每孔5×105个/ml 接种入6孔板，37℃细胞培养箱内培养过夜，待第2天细胞刚好铺满，用20μl 枪头抵住直尺，垂直于横线进行划痕，PBS洗2次，分别加入无血清培养基，于100倍镜下拍照，记录0 h 划痕位置及宽度，继续培养24 h后，在100倍镜下选取与0 h 同一位置视野进行拍照，测定细胞迁移距离，计算划痕愈合率，计算公式：愈合率=（0 h划痕宽度-24 h 划痕宽度）/（0 h 划痕宽度），实验重复3次，取平均值。

1.2.8 Transwell实验检测细胞侵袭能力将生长于对数期的实验组及siRNA-NC组细胞用胰酶消化并吹打均匀，1 000 r/min 离心3 min，用不含血清的RPMI 1640培养基重悬细胞，细胞计数并将细胞密度调整至2×104个/ml，取200μl 细胞悬液接种于Transwell小室上室，下室加入含10% FBS的完全培养基，培养24 h后用PBS轻洗2遍，甲醇固定细胞，用棉签小心擦拭掉上室细胞，0.1%结晶紫溶液染色，染色30 min后显微镜下100倍视野观察，分别取左上、左下、右上、右下及中间共5个视野，计算穿膜细胞数，实验重复3次，取平均值。

1.2.9 Western blotting提取siRNA-1组、siRNA-3组及siRNA-NC组细胞总RNA及蛋白，用qRT-PCR反应验证PTEN及Akt的表达，重复3次，每次将siRNA-NC组表达量设置为1，计算实验组PTEN及Akt相对表达量。Western blotting检测蛋白相对表达量，BCA 法测定蛋白浓度，各取40 mg 蛋白加入上样缓冲液，100℃煮5 min 变性，10% SDS-PAGE 电泳胶上样，电泳条件：浓缩胶80 V至蛋白Marker分离后，加大电压到120 V至溴酚蓝跑至胶底；转膜条件：恒压100 V 转90 min，含5%脱脂奶粉的TBST 工作液室温封闭1 h，加入一抗，4℃过夜，TBST洗3遍，5 min/次，二抗室温孵育1 h，ECL液显影，并计算灰度值，每次将siRNA-NC组表达量设置为1，计算实验组PTEN、Akt及p-Akt相对表达量，实验重复3次，取平均值。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0 统计软件。计量资料以均数±标准差 （±s）表示，比较用t检验、单因素方差分析或重量复测量设计的方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验；计数资料以构成比表示，比较用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同癌组织及癌旁组织lncRNA MIR31HG相对表达量比较

GEPIA数据库在线分析显示，宫颈鳞状细胞癌、乳头状肾细胞癌、头颈部鳞癌、胰腺癌、甲状腺癌、膀胱癌及前列腺癌组织与癌旁组织lncRNA MIR31HG相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05），宫颈鳞状细胞癌、乳头状肾细胞癌、头颈部鳞癌、胰腺癌及甲状腺癌组织较癌旁组织高，膀胱癌、前列腺癌组织较癌旁组织低。见表1和图1。

表1 不同癌组织及癌旁组织lncRNA MIR31HG相对表达量比较 （n=48，±s）

表1 不同癌组织及癌旁组织lncRNA MIR31HG相对表达量比较 （n=48，±s）

类型 宫颈鳞状细胞癌 乳头状肾细胞癌 头颈部鳞癌 胰腺癌 甲状腺癌 膀胱癌 前列腺癌癌组织 1.433±0.541 1.592±0.644 2.883±0.963 0.997±0.523 2.010±0.880 1.024±0.248 0.081±0.042癌旁组织 0.084±0.036 0.294±0.128 1.314±0.514 0.124±0.051 0.551±0.282 1.875±0.427 0.364±0.127 t值 8.976 15.530 10.670 21.730 29.450 10.424 27.011 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

图1 不同癌组织及癌旁组织lncRNA MIR31HG相对表达量比较 （n=48，±s）

2.2 PTC组织与癌旁组织lncRNA MIR31HG相对表达量比较

PTC组织与癌旁组织lncRNA MIR31HG相对表达量分别为（6.650±0.700）和（2.515±0.221），经t检验，差异有统计学意义（t=5.635，P=0.000），PTC组织较癌旁组织高（见图2）。以lncRNA MIR31HG 中位表达量为界，将患者分为高表达组和低表达组，各24例，高表达组与低表达组患者肿瘤大小、肿瘤分期及淋巴结转移比较，差异有统计学意义（P＜0.05）（见表2）。

图2 PTC组织与癌旁组织lncRNA MIR31HG相对表达量比较

表2 lncRNA MIR31HG 在PTC组织与癌旁组织的相对表达量比较 （n=24）

2.3 不同PTC细胞系lncRNA MIR31HG相对表达量比较

将甲状腺正常细胞系Nthy-ori 3-1的lncRNA MIR31HG相对表达量设为（1.00±0.00），PTC细胞系TPC-1、K1及BCPAP的lncRNA MIR31HG相对表达量分别为（2.43±0.08）、（1.74±0.05）和（4.38±0.11），经方差分析，差异有统计学意义（F=431.300，P=0.000），TPC-1、K1及BCPAP较Nthy-ori 3-1高，且TPC-1相对表达量最高。见图3。

图3 不同PTC细胞系lncRNA MIR31HG相对表达量比较 （±s）

2.4 lncRNA MIR31HG基因沉默对TPC-1 细胞增殖能力的影响

2.4.1 沉默效率验证将siRNA-NC组lncRNA MIR31HG相对表达量设为（1.000±0.000），siRNA-1组、siRNA-2组及siRNA-3组分别为（0.320±0.020）、（0.540±0.021）和（0.280±0.015），经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=330.300，P=0.000），实验组均较siRNA-NC组下降，其中siRNA-1组与siRNA-3组沉默效率均＞60%（见图4），因此选取siRNA-1与siRNA-3 小干扰RNA 用于后续实验研究。

2.4.2 细胞活力验证siRNA-NC组、siRNA-1组、siRNA-3组0、24、48、72及96 h的OD值比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点的OD值比较，差异有统计学意义（F=14 192.911，P=0.000）；②各组OD值比较，差异有统计学意义（F=3 661.345，P=0.000）；③各组OD值变化趋势比较，差异有统计学意义（F=2 374.012，P=0.000）。lncRNA MIR31HG 沉默可明显降低TPC-1的增殖能力。见表3和图5。

2.5 lncRNA MIR31HG基因沉默对TPC-1 细胞迁移及侵袭能力的影响

图4 各组lncRNA MIR31HG相对表达量比较 （±s）

siRNA-NC组、siRNA-1组及siRNA-3组24 h 划痕愈合率分别为（74.7±0.91）%、（36.1±1.13）%和（20.53±1.60）%，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=442.700，P=0.000）；siRNA-1组与siRNA-3组较siRNA-NC组降低，表明lncRNA MIR31HG 沉默可明显降低TPC-1 细胞的迁移能力。见图6、7。

siRNA-NC组、siRNA-1组及siRNA-3组侵袭至Transwell 小室下室的细胞数分别为（423.00±11.93）、（240.00±12.10）和（224.00±9.45）个，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=97.200，P=0.000）；siRNA-1组、siRNA-3组较siRNA-NC组降低，表明lncRNA MIR31HG沉默可明显抑制TPC-1 细胞的侵袭能力。见图8、9。

表3 各组不同时间点OD值比较 （±s）

表3 各组不同时间点OD值比较 （±s）

组别 0 h 24 h 48 h 72 h 96 h siRNA-NC组 0.205±0.003 0.355±0.033 0.643±0.032 1.251±0.033 2.176±0.055 siRNA-1组 0.206±0.005 0.275±0.003 0.453±0.006 0.791±0.005 1.226±0.015 siRNA-3组 0.206±0.002 0.266±0.004 0.404±0.009 0.686±0.007 1.128±0.015

图5 各组不同时间点OD值变化趋势 （±s）

2.6 lncRNA MIR31HG基因沉默对Akt信号通路的影响

各组PTEN mRNA、PTEN蛋白及p-Akt蛋白相对表达量比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；siRNA-1组、siRNA-3组PTEN mRNA和蛋白相对表达量较siRNA-NC组升高，且siRNA-3组最高；siRNA-1组、siRNA-3组p-Akt 蛋白较siRNA-NC组降低，且siRNA-3组最低。各组Akt mRNA和蛋白相对表达量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）表明lncRNA MIR31HG 沉默可明显升高PTEN基因的表达，从而抑制Akt的磷酸化。见表4和图10。

图6 各组细胞划痕实验结果 （×100）

图7 各组细胞24 h 划痕愈合率比较 （±s）

图8 各组侵袭细胞数比较 （±s）

图9 各组Transwell 小室侵袭实验结果 （×100）

表4 各组PTEN、Akt及p-Akt mRNA和蛋白的相对表达量比较 （±s）

表4 各组PTEN、Akt及p-Akt mRNA和蛋白的相对表达量比较 （±s）

注：①与siRNA-NC组比较，P＜0.05；②与siRNA-1组比较，P＜0.05。

组别 PTEN mRNA PTEN 蛋白 Akt mRNA Akt 蛋白 p-Akt 蛋白siRNA-NC组 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 siRNA-1组 2.107±0.047① 2.247±0.035① 1.093±0.038 1.077±0.019 0.510±0.017①siRNA-3组 2.537±0.136①② 2.683±0.081①② 1.017±0.034 1.083±0.035 0.413±0.019①②F值 91.290 295.200 2.909 4.049 460.600 P值 0.000 0.000 0.131 0.077 0.000

图10 lncRNA MIR31HG基因沉默对Akt信号通路的影响

3 讨论

有研究发现多种lncRNA的异常表达与甲状腺癌的发生、发展密切相关[8-10]。虽然lncRNA 没有开放阅读框，不能编码蛋白，但其通过调控基因表达、翻译后修饰、蛋白稳定性及活性等方式在细胞功能的调控上发挥重要作用。越来越多的研究表明lncRNA的异常表达在肿瘤的发生、发展中发挥了重要作用，lncRNA 通过吸附miRNA 形成ceRNA，从而调控基因的表达是其发挥作用的主要机制之一[11-12]。

lncRNA MIR31HG是miR-31的宿主基因，在多种肿瘤中表达异常，有研究发现lncRNA MIR31HG 在肺癌中高表达，并与患者的不良预后密切相关[13]。其通过与miRNA-214 结合，调控下游基因表达，从而调控非小细胞肺癌的侵袭、转移[14]。ZHENG 等[15]发现lncRNA MIR31HG还可以通过Wnt/β-catenin信号通路来调控肺癌的侵袭、转移。WANG 等[16]发现lncRNA MIR31HG 可以通过激活EGFR/PI3K/Akt信号通路增加非小细胞肺癌对吉非替尼的耐药性。lncRNA MIR31HG的高表达在胰腺癌、口腔癌等癌症中同样发挥了促进肿瘤增殖、侵袭及迁移的作用[6、17]。然而也有研究发现在肝癌、胃癌及食管鳞状细胞癌中，lncRNA MIR31HG与肿瘤的临床分期及预后密切相关，其表达下调可抑制肿瘤的发生、发展[7，18-19]。lncRNA MIR31HG 在PTC的作用及机制尚未有报道。

本研究通过数据库分析TCGA 病例资料，结合笔者收集的病例资料发现，PTC组织lncRNA MIR31HG相对表达量较癌旁组织升高，其表达水平与患者肿瘤大小、肿瘤分期及淋巴结转移情况关系密切。在体外细胞实验中笔者发现，lncRNA MIR31HG的沉默抑制了TPC-1 细胞系的增殖及迁移、侵袭能力。

为进一步探究lncRNA MIR31HG在PTC发生、发展中的作用及机制，笔者通过文献阅读发现lncRNA MIR31HG可以激活Akt 通路[19]。笔者通过在线数据库miRDB（www.mirdb.org）及miRBase（www.mirbase.org）等网站发现miRNA-575及miRNA-214可以靶向PTEN基因的3'UTR，调控PTEN基因的表达。PTEN基因作为抑癌基因，在Akt 去磷酸化、抑制Akt活化及Akt下游通路的激活方面具有重要作用。本实验发现lncRNA MIR31HG 沉默可明显高PTEN基因的表达，但对Akt表达无明显影响，然而沉默lncRNA MIR31HG后p-Akt的表达明显下降，表明lncRNA MIR31HG 沉默可能靶向调控PTEN的表达，从而抑制Akt 通路的活化。

综上所述，lncRNA MIR31HG在PTC组织及细胞系中高表达，与患者肿瘤大小及淋巴结转移密切相关，下调lncRNA MIR31HG可以抑制TPC-1细胞的增殖、迁移及侵袭能力，其机制可能与lncRNA MIR31HG 通过吸附miRNA 形成ceRNA 调控PTEN表达，从而调控Akt 通路的活化相关。lncRNA MIR31HG 可作为PTC 潜在的预后标志物及治疗靶点。