华金双，邵素菊，郑 洁，何竹青，杨京京，胡晓京，徐 宁，田 丽

(河南中医药大学针灸推拿学院，郑州 450046)

支气管哮喘是一种以气道炎症、气道高反应性、可逆性气道阻塞和气道重塑为主要特征的慢性气道疾病[1]。目前多数学者认为支气管哮喘是一种免疫异常导致的变态反应性疾病，免疫功能紊乱在哮喘发病中起十分重要的作用，而辅助性T细胞在其中更是发挥着关键性作用[2]。Thl/Th2细胞失衡被认为是哮喘免疫学机制的发病基础，尤其是向Th2细胞的偏移，因此纠正和阻止Thl/Th2细胞失衡是治疗支气管哮喘的关键和目标。Th2细胞表达转录因子GATA结合蛋白3(GATA-3)，促进B细胞增殖及IgE合成，介导体液免疫应答。Th2功能亢进时，促进嗜酸性粒细胞(EOS)、肥大细胞、淋巴细胞等炎症细胞在效应部位趋化、募集并活化，释放活性物质，引起气道炎症的蔓延。本实验旨在探讨以“邵氏五针法”为主的针灸方法对慢性哮喘大鼠免疫机制的影响，揭示针灸对哮喘大鼠Th1/Th2的上下游基因及细胞因子T-bet、GATA-3、白介素(IL)-5、γ干扰素(IFN-γ)的调控，从多角度、多层次阐明针灸治疗慢性哮喘的分子生物学机制。

1 材料

1.1 动物及分组

SPF级健康雄性SD大鼠40只，体质量160 g～180 g，由河南省实验动物中心提供，动物许可证号SCXK(豫)2017-0001。将大鼠在SPF级实验室饲养1周，饲养温度20～25 ℃，相对湿度50%～60%，期间自由饮食。按随机数字表法分为空白组、模型组、针刺组、艾灸组。本实验已通过河南中医药大学第三附属医院实验动物伦理委员会审查。

1.2 试剂及仪器

IL-5、IFN-γ大鼠血清Elisa试剂盒(货号分别为CK-E30490R、CK-E30654R，苏州卡尔文生物科技有限公司)；卵蛋白(OVA，美国Sigma公司)；氢氧化铝干粉、生理盐水、针灸针(0.30 mm×13 mm)；细艾条(0.7 cm×12 cm，湖香艾生物科技有限公司)；NE-C30型压缩式雾化器(大连欧姆龙有限公司)；RM2015型切片机(德国Leica公司)；BX43型光学显微镜(日本OLYMpUS公司)；计算机图像处理系统CMOS(日本OLYMPUS公司)及专用软件(美国Media Cybernetics 公司Image-pro plus)；ABI7500型荧光定量PCR仪。

2 方法

2.1 造模方法

参考palmans等[3-4]方法制备慢性哮喘大鼠模型。

2.1.1 致敏 除空白组用生理盐水外，其余各组动物均以新鲜配制的10%复合OVA抗原溶液(每1 ml抗原液中含有OVA100 mg，氢氧化铝干粉100 mg)1ml进行腹腔注射致敏。在实验的第1、8天各注射1次共2次，使大鼠致敏。

2.1.2 激发 在实验的第15天将大鼠置于密闭的雾化箱内，由压缩雾化器喷入1%的卵蛋白溶液30 min激发哮喘，隔天1次，连续6周。激发时大鼠出现呼吸急促，喘息，喷嚏，烦躁不安，行动迟缓甚至俯伏不动，连续激发后上述症状加重，毛色暗淡无光泽，活动减少，反应迟缓即为造模成功。

2.2 各组大鼠处理方法

2.2.1 针刺组 取穴肺俞(双)、大椎、风门(双)、足三里，每次激发前针刺隔日1次，连续6周。操作：常规消毒后以0.30 mm×13 mm针灸针直刺大椎、风门(双)、肺俞(双)、足三里，大椎直刺5 mm，风门、肺俞直刺6 mm，足三里直刺7 mm，每隔10 min均匀提插捻转1次，每次留针20 min。

2.2.2 艾灸组 取穴同针刺组。每次激发前实验人员手持细艾条行温和灸法，使艾条距离上述穴位约2～3 cm，每次灸15 min，隔日1次，连续6周。

2.2.3 空白组和模型组 空白组按照模型制备方法，用生理盐水代替卵蛋白；模型组按照模型制备方法造模，2组大鼠每天给予同样的抓握刺激，不做任何治疗。

2.3 取材方法

每组最后1次治疗结束后24 h内用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(0.35 ml/100 g)，脱颈椎处死大鼠后迅速打开胸腔暴露心脏，用l0ml注射器抽取血液置于普通试管，静置30 min，离心(3000 r/min，10 min)后取上清，-20 ℃保存。取右肺中下叶，用4 ℃生理盐水将其漂洗干净后，立即放入新鲜配制的4%多聚甲醛溶液中固定，石蜡包埋，苏木素-伊红(HE)染色，光镜下观察肺组织病理学形态变化。取左肺组织黄豆粒大小，用4 ℃生理盐水漂洗血迹，放入DEPC处理过的2 ml冻存管内，投入液氮罐，3 h内置-70 ℃冰箱冻存，待用于RT-PCR检测。

2.4 肺组织病理切片

肺组织常规石蜡包埋，二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗，苏木素染色，常规脱水、透明、中性树胶封片，光学显微镜下观察各组大鼠肺组织病理形态学变化。

2.5 血清IL-5、IFN-γ含量测定

采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定大鼠血清 IL-5、IFN-γ含量，具体步骤按照试剂盒说明书操作。

2.6 肺组织T-bet、GATA-3mRNA检测

表1示，用Trizol提取组织样本中总RNA，使用PCR仪将1 μg总RNA反转录为cDNA，各样品目的基因和内参基因引物序列及其产物长度，PCR反应条件：95℃15 min，95℃10 s，58℃30 s，72℃30 s，40循环，可得到模板循环数与荧光强度的关系，其中横坐标代表PCR反应的循环数，即Ct值。根据Real Time PCR原始检测结果，按照2-△△ct相对定量计算公式，计算出各样品的目的基因相对定量结果。

表1 T-bet、GATA-3基因定量PCR引物序列

图1 各组大鼠肺组织切片HE染色(×400)

2.7 统计学方法

3 结果

3.1 各组大鼠肺组织病理形态分析

空白组大鼠肺组织形态结构未见明显异常，肺泡及肺泡间隔形态结构基本正常，支气管管腔规则，无炎性细胞浸润。模型组大鼠气管、肺间质、小血管周围可见大量炎性细胞浸润，支气管管腔狭窄，气道黏膜水肿明显，可见上皮细胞脱落。针刺组和艾灸组同样可见气管及其周围炎性细胞浸润，气道黏膜水肿，但与模型组比较炎性细胞浸润程度明显降低。

3.2 各组大鼠血清IL-5、IFN-γ含量及肺组织T-bet、GATA-3mRNA表达

表2示，与空白组比较，模型组大鼠IL-5含量明显升高(P<0.01)；与模型组比较，针刺组和艾灸组IL-5含量均明显降低(P<0.01)。与空白组比较，模型组大鼠IFN-γ含量明显降低(P<0.01)，与模型组比较，针刺组和艾灸组IFN-γ含量均明显升高(P<0.01)，针刺组和艾灸组血清IL-5、IFN-γ水平比较差异无统计学意义。

表2 各组大鼠血清IL-5、IFN-γ含量及肺组织T-bet、GATA-3mRNA表达水平比较

与空白组比较，模型组大鼠T-bet mRNA表达明显降低(P<0.01)。与模型组比较，针刺组和艾灸组T-betmRNA表达均明显升高(P<0.01)。与空白组比较，模型组大鼠GATA-3 mRNA表达明显升高(P<0.01)，与模型组比较，针刺组和艾灸组GATA-3mRNA表达均明显降低(P<0.01)。针刺组和艾灸组肺组织T-bet、GATA-3 mRNA表达比较差异均无统计学意义。

4 讨论

支气管哮喘是一种免疫异常导致的变态反应性疾病，其中Thl/Th2失衡理论被认为是哮喘形成和发展的重要原因。Th2 细胞是CD4+辅助性T细胞的重要亚群，主要分泌IL-4、IL-5、IL-13、肿瘤坏死因子(TNF-a)等，其中IL-4主要促进B细胞增殖及IgE合成[5]，IL-5 能促进嗜酸性粒细胞的聚集，IL-13通过促进黏液分泌和加重气道高反应性而引发哮喘。GATA-3是Th2细胞分化必不可少的转录因子，其表达在Th2谱系分化的细胞中显著上调[6]。研究证明，GATA-3可以驱动Th2细胞分化和诱导Th2型细胞因子的表达，IL-4、IL-5 和 IL-13 的基因启动子区域都包含有GATA-3的结合位点，GATA-3通过上调IL-4、IL-5等Th2型细胞因子的表达，加重气道的炎症浸润，促进哮喘的发生和发展。另一方面，GATA-3还可通过抑制Thl特异性转录因子T-bet促进Th2细胞分化，对多种靶基因起到促进和抑制作用[7]。T-bet是Thl的特异性转录因子，在调节Th1谱系细胞发育中起关键作用[8]，能够阻断或抑制Th2的分化信号，还能诱导已经定向分化的Th2细胞向相反的Thl方向转化。在T-bet基因完全敲除的大鼠能够发现与过敏哮喘相类似的病理炎症改变[9]。Th1细胞可分泌IFN-γ，IFN-γ与受体结合后能够激活T-bet基因，促使细胞向Th1方向分化，对哮喘的慢性气道炎症具有明显的抑制效果。本实验研究显示，哮喘模型组大鼠血清IL-5含量及GATA-3 mRNA表达较空白组大鼠明显升高，而血清IFN-γ含量及T-bet mRNA表达却明显降低，说明GATA-3可能一方面通过诱导Th2型细胞因子IL-5的表达，导致气道炎症的发生；另一方面也有效抑制Thl分泌细胞因子IFN-γ，阻断其激活Thl特异性转录因子T-bet，从而引发哮喘。钱丽娟等[10]研究发现，GATA-3可直接调控哮喘小鼠肺组织中IL-5、IL-13表达，参与哮喘呼吸道炎症的发生。这与本研究结果一致，说明针刺和艾灸可能是通过调控T-bet、GATA-3等转录因子的表达，从而影响IL-5、IFN-γ等细胞因子的分泌，进而纠正Thl/Th2失衡，发挥防治哮喘的作用。

本研究采用的技术方案以全国著名针灸专家邵经明集60余年经验总结出来的哮喘经验处方“邵氏五针法”为主。肺俞是肺的背俞穴，为治疗肺系内伤外感诸疾之要穴，具有调补肺气、祛邪解表、止咳平喘等作用；大椎属督脉穴，为诸阳之会，具有宣阳解表、祛风散寒、理气降逆、宣肺平喘之功；风门属足太阳膀胱经穴，可疏风解表，调理肺气，止咳平喘。辅以足阳明胃经的合穴足三里，具有健脾和胃、培土生金、扶助正气之功。诸穴合用意在宣肺平喘，扶正固本，提高机体的抗病能力，减少哮喘的发作次数及严重程度。本研究中观察到，哮喘模型大鼠气道内大量炎性细胞浸润，GATA-3表达升高，Th2细胞因子IL-5分泌增加，表现出明显的向Th2细胞偏移。针刺组和艾灸组干预后，GATA-3mRNA及IL-5含量明显降低，T-betm RNA表达明显升高，Th1细胞因子IFN-γ分泌增加明显，说明不论针刺或者艾灸均可通过调节哮喘大鼠Th1/Th2上下游基因及细胞因子T-bet、GATA-3、IL-5、IFN-γ的表达，使Th1/Th2失衡得以纠正，从而降低哮喘大鼠的气道高反应性及慢性炎症，达到防治哮喘的作用。