尚家驹，孙 淳，刘华一△

(1. 天津市中医药研究院附属医院,天津 300120； 2. 天津中医药大学第一附属医院,天津 300381)

高尿酸血症(hyperuricemia，HUA)是嘌呤代谢紊乱和(或)尿酸排泄障碍引起的代谢性疾病[1]。该病作为痛风的主要危险因素[2]，在中国有很高的患病率[3]。脾虚失运而致痰瘀内生是高尿酸血症临床常见的中医证候表现[4-5]。现代医学治疗本病尚存在不足[6]，虽已有一些随机对照临床试验或系统评价[7-8]证明中医药治疗对HUA有效，但其作用机制尚未完全阐明，仍需开展大量的动物实验研究。因此，建立适宜的HUA与中医证候相结合的动物模型，是开展中医药治疗HUA作用机制研究的基础和重点方向。目前已有的中医药治疗HUA作用机制研究的动物实验多采用单纯高尿酸血症动物模型[9]，但未同时模拟出中医证候，与临床中医辨证论治HUA的实践存在一定差距是此类单纯疾病模型的缺陷。

本研究采用氧嗪酸钾+高嘌呤肥甘厚味饲料喂养+小笼环境制备高尿酸血症脾虚证病证结合大鼠模型，模型建立后，通过测量血清尿酸水平、外观行为评分、血清D-木糖水平和力竭游泳时间等病证指标，对病证结合模型进行综合评价，旨在建立一种可为中医药作用机制研究提供参考的疾病证候相结合的脾虚证高尿酸血症大鼠模型。

1 材料

1.1 动物

SPF级健康雄性SD大鼠40只，6周龄，体质量(200±10)g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号为SCXK(京)2014-0008。饲养于天津中医药大学实验动物中心动物房，饲养期间保持环境温度(22±2)℃，相对湿度(50±10)%，自然光暗周期，自由进食和饮水。本实验已经通过天津中医药大学实验动物伦理委员会审查。

1.2 试剂

氧嗪酸钾(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号C1808048)；D-木糖(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号E1605026)；尿酸(UA)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20180906)；D-木糖检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20180908)。

1.3 仪器

电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司CPA)；低速自动平衡离心机(北京医用离心机厂LDZ5-2)；电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器厂)；多功能微孔读板机(PerkinElmer2390-0000)；紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司T6新世纪)。

2 方法

2.1 肥甘厚味、高嘌呤及高嘌呤肥甘厚味饲料的制备

参考前期造模经验制定饲料配方如下：肥甘厚味饲料配方为80%基础饲料、10%猪油、10%全脂奶粉，高嘌饲料配方为80%基础饲料、10%酵母、10%果糖，高嘌呤肥甘厚味饲料配方为60%基础饲料、10%酵母、10%果糖、10%猪油、10%全脂奶粉，以上饲料由北京华阜康生物科技股份有限公司加工制成。

2.2 分组

适应性喂养3 d后，将40只SD大鼠按随机数字表法分为对照组、脾虚证组(简称证组)、高尿酸血症组(简称病组)、高尿酸血症脾虚证病证结合组(简称病证结合组)，每组各10只。

2.3 高尿酸血症脾虚证病证结合大鼠模型的建立

图1示，采用“氧嗪酸钾+高嘌呤肥甘厚味饲料喂养+小笼环境”多因素法进行造模：对照组、病组每5只大鼠置于R5型实验鼠笼(535 mm×390 mm×200 mm)中饲养，证组、病证结合组每5只大鼠置于R3型实验鼠笼(460 mm×300×180 mm)中饲养。1 d～28 d：对照组给予基础饲料，病组给予高嘌呤饲料，证组给予肥甘厚味饲料，病证结合组给予高嘌呤肥甘厚味饲料。15 d～28 d：对照组、证组给予生理盐水1 ml腹腔注射，病组、病证结合组给予氧嗪酸钾混悬液1 ml腹腔注射，每日上午7时注射1次，连续14 d。

图1 高尿酸血症脾虚证病证结合大鼠模型造模方法示意图

2.4 模型评价指标及方法

2.4.1 外观行为及体质量观测 表1示，每周三、六观察记录各组大鼠的外观及行为变化，参考大鼠外观行为评分标准[10]进行赋分，取1周内2次分数的均值作为本周的外观行为得分，每周日记录各组大鼠体质量。

表1 大鼠外观行为评分标准

2.4.2 血清尿酸及D-木糖含量测定 21 d～28 d：全部大鼠于上午9时按1 ml/100 g剂量给予3% D-木糖溶液灌胃，上午10时乙醚麻醉，目内眦取血。取血后室温静置1 h，3000 r/min离心10 min，取上层血清，-20 ℃冰箱中保存备用。采用酶比色法测量血清尿酸含量，间苯三酚法测量血清D-木糖含量。

2.4.3 力竭游泳时间测定 20 d～27 d：将负重大鼠(于大鼠尾根部缠绕重量为该大鼠体质量10%的铁丝)置于水深50 cm、水温20 ℃的水槽中游泳，以力竭即大鼠鼻尖没入水面5 s为度，记录所用时间。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 外观行为

表2示，实验期间对照组、病组大鼠外观行为未见明显变化。从造模第2周开始，证组、病证结合组大鼠逐渐出现活动减少、皮毛发黄少光泽、饮食减少、大便变软等表现并持续至第4周造模结束。与对照组比较，证组、病证结合组的外观行为积分自第2周开始增加，差异有统计学意义(P<0.05)。提示造模后，证组、病证结合组大鼠表现出中医脾虚证的证候特征。

表2 大鼠外观行为积分比较(分，

3.2 体质量

表3示，实验期间对照组大鼠体质量逐渐增加，符合大鼠的生长规律，差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，证组、病证结合组体质量自第2周均见降低，差异有统计学意义(P<0.05)。提示造模后，证组、病证结合组大鼠消化吸收能力下降，脾胃功能呈受损状态。

表3 大鼠体质量比较

3.3 血清尿酸水平

表4示，与对照组比较，证组大鼠血清尿酸含量差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组比较，病组、病证结合组血清尿酸含量均上升，差异有统计学意义(P<0.05)，提示造模后病组、病证结合组大鼠处于高尿酸血症状态。

3.4 血清D-木糖含量

表4示，与对照组比较，病组大鼠血清D-木糖含量差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组比较，证组、病证结合组血清D-木糖含量均下降，差异有统计学意义(P<0.05)，提示造模后证组、病证结合组大鼠的消化功能减弱，即脾虚而失于运化。

3.5 力竭游泳时间

表4示，与对照组比较，病组大鼠力竭游泳时间差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组比较，证组、病证结合组力竭游泳时间均下降，差异有统计学意义(P<0.05)，提示造模后证组、病证结合组大鼠的耐力下降，即脾气虚。

表4 大鼠血清尿酸水平、血清D-木糖水平及力竭游泳时间比较

4 讨论

高尿酸血症疾病模型屡见不鲜[11]，但高尿酸血症与中医证候相结合的病证结合模型却鲜见报道。中医药治疗高尿酸血症应从“证”入手，建立高尿酸血症病证结合模型是从中医临床实际出发，以服务临床实践为目的的迫切需要。

4.1 高尿酸血症模型的建立及评价

采用国际上制备高尿酸血症模型普遍认可的氧嗪酸钾[12](抑制尿酸分解)作为主要造模剂，根据文献报道及前期造模经验辅以含有果糖[13]及酵母[14]的高嘌呤饲料(增加尿酸合成)建立高尿酸血症模型，通过检测大鼠血清尿酸水平评价造模是否成功。实验结果表明，病组、病证结合组大鼠在高嘌呤饲料喂养4周的基础上，于第3、4周联合氧嗪酸钾(200 mg/kg)连续腹腔注射2周，可使血尿酸达到较高水平且能维持1周。

4.2 脾虚证模型的建立及评价

物质生活水平的提升和精神压力的增加促进了现代人过食肥甘厚味饮食方式及好逸少动生活方式的形成。而“太饱则脾阻，过逸则脾滞，脾气困滞而少健运”(《温热经纬·薛生白湿热病篇》)，过食、过逸伤脾可形成脾虚之证。故基于过食过逸伤脾的中医理论，采用肥甘厚味饲料模拟过食肥甘厚味的饮食方式、小笼环境模拟过逸少动的生活方式以制备中医脾虚证模型。在模型评价方面，既通过制定量表对大鼠的外观行为进行观察评分以半定量地反映其中医脾虚证候，又依据中医“脾主身之肌肉”(《素问·痿论篇》)“劳则气耗”(《素问·举痛论篇》)理论，以力竭游泳时间[15]衡量大鼠脾气虚的程度；同时采用公认的实验室指标D-木糖水平客观反映脾虚情况。本实验观察到，随着造模时间的推移，证组、病证结合组大鼠体质量较对照组减轻，其外观行为在造模第2周开始逐渐出现神疲乏力、形体消瘦、纳少便溏、毛发枯黄等符合中医脾虚证征象的变化，力竭游泳时间缩短及血清D-木糖水平下降，又从客观指标方面提示大鼠脾虚证候的形成。

单纯的脾虚证模型组血清尿酸水平无明显变化，同时单纯的高尿酸血症疾病模型组的脾虚征象指标无明显变化。与单纯的疾病模型或证候模型比较，病证结合模型将现代医学方法与中医基础理论相结合，能更好地同时体现西医疾病与中医证候的特点，且更符合临床实际。目前高尿酸血症中医证候动物模型的研究及报道尚少。本次实验的病证结合模型造模采用中医病因模型加西医病理模型联合造模，建立的高尿酸血症脾虚证病证结合模型既具有高尿酸血症尿酸水平升高的疾病特征，又具备脾虚证的证候并提示脾虚证的阳性实验室指标，适用于临床诊断为高尿酸血症且中医辨证证属脾虚患者的中医药治疗机制研究。本次实验在病证结合高尿酸血症动物模型制备方面进行了初步探索，模型的成功建立对于中药药效评价和中药作用机理研究具有一定意义，能更好地为临床诊疗服务。

实际临床中，脾虚证患者多表现为慢性病程，提示脾虚证的形成是一个较长期的过程。本次实验造模时间为4周相对较短，未来可适当延长造模时间并进行观察总结。本次实验尚缺乏药物的反证，接下来或可增加以方测证的方法，以验证制备模型中医证候的准确性。本研究是从病与证两方面分别造模最终组合而成的病证结合模型，今后应寻找能同时制备病与证的造模方法，以优化造模过程。