郑开福 刘宇健 唐希阳 姜涛 李小飞 赵晋波

气管是连接肺和外界大气的唯一通道，对维持生命具有至关重要的作用。目前手术切除重建是治疗长段气管损伤、肿瘤、狭窄等疾病最主要的方式之一。然而由于气管的活动度较小，切除的长度过长会因吻合口张力过大导致手术失败，目前临床上气管切除的长度极限为6 cm或不超过儿童气管的1/3[1-2]。因此对于长段气管的切除重建是临床上一个具有挑战性的难题，其中组织工程气管是目前气管替代物研究中的热点。随着3D打印技术的发展，将3D打印技术与组织工程技术相结合成为一个新的研究方向，通过打造与原生气管生物性能更加接近的组织工程气管[3]，可能为临床治疗长段气管缺损提供更好的方式。在3D打印技术应用于气管重建的研究中，最常用的一种应用是采用3D打印技术构建气管支架，通过支架来进行组织工程的再生；此外，另外一种应用是采用3D打印技术将种子细胞等进行植入和三维立体培养，此类应用涉及到生物3D打印的范畴，在本文中暂时不做讨论。

一、3D打印气管支架的材料与设计

气管由于其解剖位置的特殊性，要求3D打印气管支架不仅要具备足够的强度以维持通气功能，同时还需要有一定的活动性，能够抵抗一定的弯曲和旋转所带来的应力。材料和支架结构的设计是影响支架性能的重要因素。

目前用于3D打印的材料主要包括天然聚合物和合成聚合物[4]。与合成聚合物相比，天然聚合物拥有更好的生物相容性，更有利于人工气管周围组织的长入，促进气管再血管化、气管软骨及纤毛上皮的再生，但是天然聚合物的力学性能较低，限制了其在气管支架中的应用。合成聚合物具有更好的稳定性以及更高的强度，因此气管支架的制造多采用合成聚合物，包括聚己内酯（polycaprolactone，PCL）、聚氨酯（polyurethane，PU）、聚乳酸（polylactic acid，PLL A）、聚乳酸羟基乙酸（poly lactoglycolic acid，PLGA）等[5]。PCL由于其优异的生化特性，如熔点低、无毒、可降解、生物相容性好、较强的抗拉伸性[6]，使PCL成为气管支架研究中应用最广泛的材料。但PCL材料是否是最适合用于气管支架的制造并没有明确的答案。Ahn等[7]采用PU和PCL设计了相同的支架结构，结果显示PU材料制造的气管比PCL的机械性能更好。目前关于不同材料的气管支架的对比研究较少，同时材料学的迅速发展，各种新型材料也层出不穷，何种材料最适合于气管替代物的制造还需要进一步研究。

圆筒状气管与波纹状气管是目前气管支架主要的两种结构形态。Park等[8]研究表明在三点弯曲实验中，虽然圆筒状气管能够提供更强的力学强度，但是通过分析整体的压力分布发现圆筒状气管的压力集中在受压点，形变程度明显，管腔直径明显降低，而波纹状气管可以将压力均匀分布于整个气管，受力均匀，形变程度明显低于波纹状气管，管腔直径基本没有改变。Park等[9]将波纹状气管与原生气管相比，波纹状气管可承受的三点弯曲的强度为（1.088±0.161）MPa，原生气管为（0.214±0.125）MPa，两者差异有统计学意义。Ahn等[7]的研究中增加了3D打印气管支架在扭转维度的力学测试，结果也表明波纹状气管更加的灵活，具有更大的扭转角度。由此可见波纹状气管是相对较好的一种用于气管重建的设计方式（表1）。波纹状气管是对原生气管的一种仿生设计，因此在设计气管结构时，应考虑实验动物原生气管的软管环与软骨环的间隔以及软骨环的宽度，进而以实际数据设计波纹与波纹的间隔以及波纹的宽度，达到仿生效果。

多孔结构是3D打印组织器官研究的一个热点，目的是为促进移植物周围的细胞长入移植物。研究[10]表明孔隙直径为300 μm最适于气管组织长入，同时为加快气管移植物的软骨、上皮、血管等再生，通常在气管支架上种植上皮细胞、软骨细胞、间充质干细胞等。但是研究[11]表明接种的细胞剂量与气管移植物发生狭窄密切相关，随着种植细胞剂量的提高，气管移植物的功能可随之得到改善。Best等[11]设计了多孔和无孔的C型环气管支架并进行对比，结果显示在相同培养条件下，无孔气管支架的细胞增殖的密度高于多孔气管支架，两者差异有统计学意义。这与传统的观念有较大的差异。因此进一步探究3D打印气管支架的空隙直径，平衡细胞种植剂量与气管组织的长入是后续研究的重要内容。另一方面，气管支架的厚度、降解速率等因素对促进细胞黏附、血管及气管软骨再生均具有重要的影响，但是目前关于这方面的研究很少，还需要进一步探索。

二、3D打印气管支架的组织再生问题

理想的气管替代物除在结构上能维持呼吸道的通畅，保证基本的通气功能外，在功能上还应该尽可能达到与原生气管一致的水平，因此在长段气管缺损的修复重建中气管替代物的再上皮化、再血管化及新生软骨形成是需要解决的3个重要问题。单纯的3D打印气管支架促进新生的上皮、血管及软骨形成的能力较弱，同时也可引起较严重的炎症反应，导致肉芽组织的生成，造成气管移植物的狭窄。为解决这些问题，不同研究团队探索不同的方法（表2），包括种植上皮细胞、耳廓软骨细胞、间充质干细胞等促进组织再生，将支架包被凝胶、细胞外基质为组织再生提供内环境等[20]。

1. 3D打印气管支架的再上皮化

气管腔内完整假复层纤毛柱状上皮是抗感染的重要因素[21]，假复层纤毛柱状上皮缺损可引起持续的炎症反应，导致肉芽组织的形成，造成气道狭窄。Chan等[15]以新西兰兔作为实验动物，使用单纯的PCL气管进行移植，随访4周发现气管替代物发生严重狭窄，狭窄程度为83%～98%，肉芽组织增生明显，仅在吻合口附近有少量纤毛上皮再生，移植物中央未见新生上皮组织。Bhora等[12]采用牛真皮细胞外基质（extracellular matrix，ECM）作为支架内衬构建人工气管，将其移植到猪的气管中，结果与Chan团队相似。刘春全等[14]将PCL气管支架复合软骨细胞进行移植，发现上皮细胞基本覆盖整个管腔需要6个月，而纤毛上皮的生成需要更长的时间。因此单纯依靠吻合口两端原生气管的上皮细胞爬行到气管移植物管腔表面难度较高，长段气管替代物的再上皮化还需依赖于在气管替代物上种植上皮细胞。Park等[13]首先将含有脱细胞的气管黏膜外基质的水凝胶覆盖在气管内表面，然后将人下鼻甲间充质干细胞片覆盖在水凝胶上构建组织工程气管。将该人工气管移植到兔气管中，结果显示2个月时兔的气管管腔光滑，新生的成熟上皮完全覆盖整个管腔表面，仅在吻合口处可见轻微的狭窄。该方法成功的使气管腔内的上皮再生，基本恢复正常气道内皮的一个正常功能，但还需要更长期的随访观察及大型动物研究进一步验证该方式的可靠性。

表1 不同材料及结构气管支架力学性能

表2 3D打印气管支架对修复长段气管缺损的研究结果

2. 3D打印气管支架的再血管化

血管是气管替代物营养供应的基本来源，新生血管的生成能够为上皮和软骨提供营养，进一步促进纤毛柱状上皮和软骨组织的生成。在气管替代物移植前进行预血管化是使用最多的方法。大网膜具有丰富的血运，Park等[9]将PCL气管在兔子的大网膜中包埋2周后取出移植，组织学检查结果显示气管支架内有大量的新生血管形成，同时气管管腔内可见纤毛柱状上皮和黏膜下层，新生组织中未见明显炎症。而在未预血管化组织出现严重的炎症反应，新生组织没有明显的结构层次。Gao等[1]将气管包埋在裸鼠背部皮下，取得了类似的结果。然而不管是包埋在大网膜还是皮下，均须取出后再进行移植。Gao等[16]将包被有软骨细胞水凝胶的PCL气管包埋在颈旁肌肉中2周，然后在原位进行气管移植。优点在于在预血管化之后不用离断气管替代物与周围组织已经形成的血管，可以为气管替代物提供长期的血供。在该研究中经过预血管化的气管替代物软骨细胞和纤毛上皮再生情况明显优于未预血管化的气管替代物。因此，预血管化是促进气管替代物血管再生的一种可行方法。

3. 3D打印气管支架的软骨形成

气管软骨是为气道提供力学支撑的重要结构，防止由于呼吸运动导致气管塌陷而发生呼吸阻塞。长段气管缺损的目标是3D打印的气管支架随着时间逐步降解，同时C型软骨逐步形成，最终由气管软骨为气管替代物提供力学支撑。

Park等[8]将肝素化的明胶海绵环与波纹状气管复合，在明胶海绵环上负载可以缓释的TGF-β1，同时种植人鼻中隔来源的软骨细胞，将该组织工程气管埋置在裸鼠背部皮下8周，结果显示明胶海绵中充满软骨样组织，阿尔新蓝和番红染色显示新生组织中含有丰富的糖胺聚糖，这进一步表明软骨的形成。由于明胶海绵为环状结构，因此新生的软骨有望形成与原生气管一样的C型软骨。葛阳等[17]采用软骨细胞膜片与3D打印聚酰胺支架复合，包埋在裸鼠皮下8周可见大量软骨陷窝形成，分泌大量细胞外基质。张恒一等[18]采用种植耳廓软骨细胞的明胶（gelatin，GT）/PCL静电纺纳米纤维膜与聚乳酸己内酯（poly DL-lactideε-caprolactone，PLCL）支架复合构建组织工程气管，发现C型环状软骨结构形成。然而，Xia等[19]将PCL复合软骨细胞的气管支架在山羊中进行移植，但是仅在吻合口处可见软骨样组织形成，这与皮下包埋的结果差距较大。因此，在气管原位移植中软骨的再生还需进一步研究。

4. 抗感染及抗炎作用

由于移植早期气管腔内的纤毛上皮还未形成，气管替代物无法顺利将异物及气道分泌物排出。Xia等[19]的研究表明导致实验动物死亡最主要的原因是由于肉芽组织增生导致气管狭窄。因此制造具有抗感染和炎症反应的支架对减轻肉芽组织生成、避免管腔狭窄具有十分重要的意义。Lee等[22]在3D打印PCL气管与普朗尼克F127非对称多孔膜复合，该膜的空隙为纳米级，能有效防止纤维结缔组织侵入气管腔，并能渗透黏膜再生所需的营养物质和氧气。研究[22]表明非对称多孔膜能够明显减轻气管腔的肉芽组织生成。另一方面，Kang等[23]的研究表明在气管支架表面采用离子液体联合氧化石墨烯修饰可以提高支架的抗感染能力。因此，后续的研究应该进一步探索气管的表面结构改性，使人工气管具有更好的组织相容性和更长的生存时间。

5. 总结

综上所述，3D打印气管支架用于长段气管缺损的修复是可行的。首先，气管支架的强度明显优于原生气管，PCL等可降解吸收材料的降解速度较慢，足以维持移植早期气管腔内的通畅。其次，通过仿生设计，支架在三点弯曲、径向压缩及扭转试验中都获得了较为满意的力学性能，基本达到原生气管的力学要求。最后，3D打印气管支架为上皮细胞、软骨细胞等黏附提供了基本骨架作用，另一方面将强度较大的支架与强度较低的细胞外基质、水凝胶等复合，在皮下、大网膜、颈旁肌肉等位置进行包埋预血管化，进一步促进3D打印气管支架的再上皮化、血管化及软骨再生。但是3D打印气管支架还存在一些问题。首先，气管支架对于机体属于异物，这可能是导致许多动物气管腔内肉芽组织增生的重要原因之一。其次，大部分研究的支架设计没有考虑到原生气管后膜的作用，使移植后气管排除异物及抗感染能力下降，影响长期的生存质量。最后，与上皮再生相比，软骨再生的周期较长，对于支架的降解速度是基于材料在体外的降解速度判断的，在体内支架的降解速度与软骨形成速度是否能够匹配还有待进一步的观察研究。

三、展望

理想的气管替代物应该具有适当的机械性能、充足的血供、完整的气管内皮组织、C型结构的软骨环[24]，最终形成与原生气管一致的气管，即纤毛柱状上皮为内衬，C型环状软骨做支撑的结构。因此，同时种植两种或两种以上细胞促进气管替代物朝原生气管方向分化可能是未来的一个重要方向。Kim团队[25-26]进行了尝试，使用新西兰兔的鼻内侧黏膜上皮细胞和耳廓软骨细胞分别与藻酸盐水凝胶在体外均匀混合，联合PCL材料，采用3D打印技术打印出5层结构的人工气管，最内层和最外层为含孔隙结构的PCL支架，中间为无空隙结构的PCL支架，两层支架之间内层为含上皮细胞的水凝胶，外层为含软骨细胞的水凝胶。但是该研究为气管部分缺损的修复（10 mm×10 mm），是否适用于长段气管缺损的修复还有待进一步研究。另一方面，随着各种新型材料的发现，还应该进一步对不同材料的3D打印气管进行对比研究，选取最佳的材料。同时气管的微观结构，包括空隙的直径、厚度、形状、表面修饰等均是影响细胞黏附的重要因素，需要进一步研究并在活体实验中进行验证。