杨博睿，张富新，邵玉宇，蔡俊娜，刘坤钰

（陕西师范大学食品工程与营养科学学院，西安710119）

0 引 言

乳中富含蛋白质、脂肪、乳糖、矿物质、维生素和多种生物活性成分，是人体摄取营养物质的主要来源[1]。目前人们可利用的乳类已有10 多种[2]，其中牛乳由于营养全面、产量大，已成为人们消费的主要乳类，约占乳类消费的85%[3]。随着人们对乳类需求的多元化及营养保健意识的提高，一些特种乳及乳制品越来越受到人们的关注，羊乳作为仅次于牛乳的第二大乳类，其独特的营养保健功能已被人们认识[4]。此外，人乳作为营养及功能最完美的乳类，其复杂的化学组成及独特的营养功能，已在人类营养界受到高度关注[5]。乳蛋白质是人们从乳中摄取的最主要的营养素，主要由酪蛋白和乳清蛋白组成，但其组成及含量在不同来源乳类之间有较大差别[6]。目前国内外对牛乳和人乳中蛋白质组成及消化利用研究较多[7-8]，在羊乳的消化特性方面也有一些报道[9]，但在系统比较牛乳、羊乳和人乳蛋白质组成及消化特性方面报道极少。因此本文在分析牛乳、羊乳和人乳中蛋白质组成的基础上，利用体外模拟胃肠消化，研究牛乳、羊乳和人乳的消化特性，为进一步开发牛乳、羊乳提供基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

羊乳采自西北农林科技大学试验农场350 只西农萨能奶山羊混合奶样；牛乳采自西安银桥乳业集团农场的300 头黑白花奶牛混合奶样；人乳采自西安市3名健康母亲3 个月内的乳汁，采样后混合均匀；乳样采集后在-40 °C 下贮存。

1.2 试剂

胃蛋白酶(活性 3 000～3 500 u)，美国 Sigma 公司；胰酶（活性1 750 u），美国Sigma 公司；猪胆盐，北京奥博星生物技术有限责任公司；SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒，Solarbio 公司；SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液（4 X）、蛋白质分子量标准（14.4～116 ku），碧云天生物技术有限公司；三氯乙酸，上海山浦化工有限公司；溴甲酚绿指示剂、甲基红指示剂，天津市科密欧化学试剂有限公司；盐酸、浓硫酸、氢氧化钠，洛阳昊华化学试剂有限公司；乙醇、甲醇、冰乙酸，天津市富宇精细化工有限公司；氯化钠、无水氯化钙、硼酸、五水硫酸铜，天津市天力化学试剂有限公司。

1.3 仪器设备

Kjeltec 全自动凯式定氮仪，瑞典福斯(Foss)公司；BSA22025 型电子分析天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；FM 恒温水浴锅，上海福玛实验设备有限公司；VORTEX-5 旋涡混合器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；PHS-3C 型精密pH 计，上海精密科学仪器有限公司；TGL-16B 型高速离心机，上海安亭科学仪器厂；Power PacTM 基础电泳仪电源和Mini-Protean Tetra Cell 电泳槽，上海创萌生物科技有限公司；THZ-300/300C 型恒温培养摇床，上海一恒科学仪器有限公司；ChemiDoc-it System 510 Imager化学发光成像仪，美国UVP 公司；DN-12 氮吹仪，上海比朗仪器有限公司。

1.4 乳蛋白质的分离及测定

乳蛋白质的分离参照GB/T 21704-2008[10]的方法。取100 mL 冷冻乳样在室温下自然解冻，然后在3 000 g 下离心 15 min 脱脂，得到脱脂乳。取 10 mL 脱脂乳用1 mol/L HCI 调整 pH 至等电点（牛乳4.6[11]，羊乳4.2[12]，人乳4.6[13]），室温下静置30 min后，在10 000 g下离心20 min，重复两次，得到沉淀部分为酪蛋白部分，上清液为非酪蛋白部分。取10 mL 非酪蛋白部分，加入15%三氯乙酸（质量浓度），使三氯乙酸最终浓度为12%，在3 500 g 下离心20 min，沉淀为乳清蛋白部分，上清液为非蛋白氮部分。样品总氮、非蛋白氮、非酪蛋白氮分别用自动凯式定氮仪测定[14]。按下面公式计算：

总蛋白=（总氮-非蛋白氮）×6.38

酪蛋白=（总氮-非蛋白氮）×6.38

乳清蛋白=（非酪蛋白氮-非蛋白氮）×6.38

1.5 体外模拟消化

乳样在室温下自然解冻后在3 500 g 下离心脱脂。取脱脂乳进行体外模拟胃液消化、肠液消化、胃肠液消化。

体外模拟胃液消化参照Pan[15]和Alison[16]方法。取 10 mL 脱脂乳于 37 °C 下预热 5 min，添加 10 mL 人工胃液（2 g NaCI 和7 mL 2 mol/L HCI 配制成1 L），用2 mol/L HCI 将乳样的pH 调整为2.0，添加0.03 g胃蛋白酶混合均匀后于37 °C 恒温水浴中消化30 min、60 min、120 min，然后用1 mol/L NaOH 调整液消化pH 至7.0 终止反应，取消化液进行SDS-PAGE凝胶电泳。

体外模拟肠液消化参照Miriam[17]和Hyeong[18]方法。取10 mL脱脂乳于37 °C下预热5 min，添加0.1 mL人工肠液（68.3 mL NaHCO3(84.7 g/L)、10 mL CaCl2·2H2O(22.2 g/L)和30 g胆盐配制成500 mL），用1 mol/L NaOH 将乳样的 pH 调整为 7.0，添加 0.005 g 胰酶（活性1750 U/mg）混合均匀后于37°C 恒温水浴中分别消化 2 min、10 min、30 min，取消化液进行 SDS-PAGE凝胶电泳。

体外模拟胃肠液消化参照体Alison[16]和Miriam[17]方法。取 10 mL 脱脂乳于 37 °C 下预热 5 min，添加10 mL 人工胃液（2 g NaCI 和 7 mL2 mol/L HCI 配制成1 L），用2 mol/L HCI 将乳样的pH 调整为2.0，添加0.03 g 胃蛋白酶混合均匀后于37 °C 恒温水浴中消化30 min，然后取出乳样添加0.1 mL 人工肠液[68.3 mL NaHCO3(84.7 g/L)、10 mL CaCl2·2H2O(22.2 g/L)和30 g 胆盐配制成 500 mL]，用 1mol/L NaOH 将乳样的pH 调整为7.0，添加0.005 g 胰酶（1750 U/mg）混合均匀后于37 °C恒温水浴中分别消化2 min、10 min、30 min，在沸水浴中煮沸5 min 终止反应，取消化液进行SDS-PAGE凝胶电泳。

1.6 SDS-PAGE凝胶电泳

参照Neuhoff[19]的方法。将13.5%的分离胶（2.25 mL 30%丙烯酰胺、1.25 mL pH 8.8 三（羟甲基）氨基甲烷（tris-HCl）、50 μL 10%十二烷基硫酸钠（SDS）、50 μL 10%-过硫酸铵（APS）、5 μL 四甲基乙二胺（TEMED）和1.4 mL超纯水）注入凝胶板中凝胶40 min，再将3.75%浓缩胶（0.313 mL 30%丙烯酰胺、0.313 mL pH 6.8 tris-HCl、25 μL 10% SDS、37.5 μL 10% APS、3.75 μL TEMED和1.813 mL 超纯水）注入凝胶板凝胶40 min，完成制胶阶段。在电泳槽内加入电极缓冲液（3.03 g tris、18.7 g 甘氨酸、1 g SDS 定容至 1 L）。将牛乳和羊乳样品用超纯水稀释10 倍，人乳样品用超纯水稀释5 倍，取 30 μL 乳样稀释液加入 10 μL 蛋白上样缓冲液（上样缓冲液∶乳样稀释液=1∶3），在沸水浴中加热5 min 使蛋白质变性。取7 μL 处理后的样品上样，开始电泳电压为75 V，当样品进入分离胶后将电压调至200 V，电泳40 min。将凝胶从凝胶板上取下，在水平摇床中用染色液（1 g 考马斯亮蓝 R-250、450 mL 甲醇、100 mL 冰乙酸定容至1 L）染色2 h。然后用脱色液（甲醇∶冰乙酸∶超纯水的比例为1∶1∶8）摇床脱色至蛋白条带清晰为止，最后用Chemi Doc-It 化学成像系统扫描进行灰度分析。

1.7 乳蛋白残留率和消化率

用化学发光成像仪对SDS-PAGE电泳条带的灰度值进行测定，然后按下列公式计算蛋白质的残留率[16]和消化率[20]：

1.8 数据处理

采用Origin9.1 对试验数据进行整理和图表编辑；采用DPS 9.50 统计分析软件对试验数据进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 牛乳、羊乳和人乳中含氮物质和蛋白质组成

2.1.1 牛乳、羊乳和人乳中含氮物质

牛乳、羊乳和人乳中含氮物质主要由酪蛋白氮(Casein Protein Nitrogen，CPN)、乳清蛋白氮（Whey Protein Nitrogen，WPN）和非蛋白氮（Non-Protein Nitrogen，NPN）组成，其含量见表1。

表1 牛乳、羊乳和人乳的含氮物质组成

由表1 可以看出，牛乳、羊乳和人乳中酪蛋白氮有显著差别（P<0.05），牛乳中酪蛋白氮含量最高，而人乳中含量最低；牛乳与羊乳中乳清蛋白氮无显著性差异（P>0.05），而人乳中含有较高的乳清蛋白氮；牛乳、羊乳和人乳中非蛋白氮也有较大差别，牛乳中非蛋白氮含量最低，而人乳中非蛋白氮含量最高。同时，从牛乳、羊乳和人乳中酪蛋白和乳清蛋白含量也可以看出，牛乳中酪蛋白含量最高，人乳中酪蛋白含量最低，牛乳、羊乳和人乳中酪蛋白与乳清蛋白的比值分别为4.45，3.65 和0.51，这表明牛乳中蛋白质主要由酪蛋白组成，人乳中蛋白质主要由乳清蛋白组成，羊乳中酪蛋白与乳清蛋白之比更接近于人乳。

2.1.2 牛乳、羊乳和人乳中蛋白质组成

乳中的蛋白质主要由酪蛋白和乳清蛋白组成。酪蛋白主要由αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白4 种酪蛋白组成，乳清蛋白主要由α-乳白蛋白和β-乳球蛋白组成。

图1 牛乳、羊乳和人乳的蛋白质电泳图

由图1 可见，牛乳、羊乳和人乳中蛋白质在SDS-PAGE 电泳中条带分离清晰，牛乳和羊乳中酪蛋白可清晰观察到αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白4 种酪蛋白条带，而人乳中仅可观察到β-酪蛋白和κ-酪蛋白条带，没有发现αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白条带，这与Maria 的报道一致[21]。同时，牛乳和羊乳中还可以观察到α-乳白蛋白和β-乳球蛋白2 种乳清蛋白条带，而在人乳中仅含有α-乳白蛋白条带，无β-乳球蛋白条带。除了4 种酪蛋白和2 种乳清蛋白外，电泳中还可观察到乳铁蛋白、血清白蛋白及免疫球蛋白条带，尤其是人乳中含有较高的乳铁蛋白和血清白蛋白。通过对SDS-PAGE 凝胶电泳条带灰度分析（见表2），发现牛乳、羊乳和人乳中4 种酪蛋白和2 种乳清蛋白含量有明显差别，在酪蛋白组成方面，牛乳中αs1-酪蛋白含量显著高于羊乳（P<0.05），而羊乳中αs2-酪蛋白含量高于牛乳（P<0.05），人乳中β-酪蛋白含量最高，显著高于牛乳和羊乳（P<0.05），同时人乳中的κ-酪蛋白也显著高于牛乳和羊乳（P<0.05）。这表明牛乳中酪蛋白主要由αs1-酪蛋白和β-酪蛋白组成，羊乳中酪蛋白主要由αs2-酪蛋白和β-酪蛋白组成，而人乳中酪蛋白主要由β-酪蛋白和κ-酪蛋白组成。从乳清蛋白组成看，人乳中α-乳白蛋白含量显著高于牛乳和羊乳（P<0.05），牛乳中β-乳球蛋白含量显著高于羊乳和人乳（P<0.05），表明牛乳中乳清蛋白主要由β-乳球蛋白组成，人乳中乳清蛋白主要由α-乳白蛋白组成，而羊乳中β-乳球蛋白含量低于牛乳。大量研究表明，乳中的αs1-酪蛋白和β-乳球蛋白是引起蛋白质过敏反应的来源[22],人乳中几乎不含αs1-酪蛋白和β-乳球蛋白，与牛乳相比，羊乳中含有较低的αs1-酪蛋白和β-乳球蛋白，这也是羊乳不易引起蛋白质过敏的主要原因。

表2 牛乳、羊乳和人乳的蛋白质组成

2.2 牛乳、羊乳和人乳中蛋白质的消化特性

2.2.1 牛乳、羊乳和人乳中蛋白质的胃液消化

牛乳、羊乳和人乳中的蛋白质在胃液中消化电泳图见图2。由图2 可见，牛乳、羊乳和人乳在整个胃液消化期间，酪蛋白(αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白)条带逐渐变暗，尤其在胃液消化120 min 时，牛乳酪蛋白条带逐渐消失，羊乳仅有少量的酪蛋白条带，人乳在消化60 min 时，酪蛋白条带也逐渐消失。由于降解产物的形成，使乳清蛋白（α-乳白蛋白和β-乳球蛋白）条带亮度有逐渐增加的趋势。通过对电泳条带灰度扫描发现，牛乳、羊乳和人乳中的蛋白质在整个胃液消化期间，随着消化时间的延长，高分子量蛋白（MW>40）和酪蛋白的残留率逐渐减少，而低分子量蛋白（MW<20）的残留率逐渐增大（见表3），表明随着胃液消化时间的延长，蛋白质的消化率逐渐提高。通过对牛乳、羊乳和人乳比较发现，在消化120 min 时牛乳高分子量蛋白（MW>40）残留率最低，羊乳和人乳无显著性差异（P>0.05），表明牛乳中高分子量蛋白（MW>40）比羊乳和人乳更易消化。从酪蛋白残留率看，整个消化期间，牛乳中酪蛋白残留率最高（P<0.05），人乳中酪蛋白残留率最低（P<0.05），表明人乳中酪蛋白在胃液中最易消化，羊乳中酪蛋白比牛乳中酪蛋白更易消化。从牛乳、羊乳和人乳中酪蛋白组分消化可以看出（见表4），牛乳和羊乳中αs1-酪蛋白在胃液消化120 min 时消化率无显著差别（P>0.05），而αs2-酪蛋白在整个消化期间牛乳消化率显著高于羊乳（P<0.05），β-酪蛋白和κ-酪蛋白在整个消化期间人乳显著高于牛乳和羊乳（P<0.05），而羊乳高于牛乳（P<0.05），这表明人乳中仅有的β-酪蛋白和κ-酪蛋白在胃液消化中最易消化，与牛乳相比，羊乳中酪蛋白在胃液消化中更易消化。

图2 牛乳、羊乳和人乳中的蛋白质模拟胃消化电泳图

表3 牛乳、羊乳和人乳在胃液消化中蛋白质的残留率 %

表4 牛乳、羊乳和人乳在胃液消化中酪蛋白的消化率 %

2.2.2 牛乳、羊乳和人乳中蛋白质的的肠液消化

牛乳、羊乳和人乳中的蛋白质在肠液中消化电泳图见图3。由图3 可见，牛乳、羊乳和人乳在整个肠液消化期间，酪蛋白(αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白)条带逐渐变暗，人乳在消化2 min 时，酪蛋白条带也逐渐消失，牛乳和羊乳在肠液消化10 min时，酪蛋白条带也逐渐消失，表明人乳酪蛋白在肠液中比牛羊乳更易消化。通过对电泳条带灰度扫描发现，牛乳、羊乳和人乳中的蛋白质在整个肠液消化期间，随着消化时间的延长，高分子量蛋白（MW>40）和酪蛋白的残留率逐渐减少，而低分子量蛋白（MW<20）的残留率有逐渐增加的趋势（见表5），这表明随着肠液消化时间的延长，蛋白质的消化率逐渐提高。通过对牛乳、羊乳和人乳比较发现，在肠液消化30 min时牛乳高分子量蛋白（MW>40）残留率最低，羊乳和人乳无显著性差异（P>0.05），表明牛乳中高分子量蛋白（MW>40）比羊乳和人乳更易消化。从酪蛋白残留率看，整个消化期间，牛乳中酪蛋白残留率最高（P<0.05），人乳中酪蛋白残留率高于羊乳（P<0.05）,表明人乳中酪蛋白在肠液中最易消化，羊乳中酪蛋白比牛乳中酪蛋白更易消化。从低分子量蛋白（MW<20）残留率来看，牛乳、羊乳和人乳的低分子量蛋白（MW<20）残留率随着消化时间的延长出现了先增高后降低的趋势，这表明高分子量蛋白和酪蛋白基本消化完全后，低分子量蛋白也逐渐被消化。除此之外，与胃液消化相比，牛乳、羊乳和人乳在肠液中消化10 min 时，90%以上的酪蛋白已消化，消化30 min时，酪蛋白几乎完全消化，表明乳蛋白主要在小肠内消化吸收，这与Alison[16]、Jasinska[23]等的报道基本一致。

2.2.3 牛乳、羊乳、人乳中蛋白质的胃肠液消化

图3 牛乳、羊乳和人乳中的蛋白质模拟肠消化电泳图

表5 牛乳、羊乳和人乳在肠液消化中蛋白质的残留率 %

图4 牛乳、羊乳和人乳中的蛋白质模拟胃肠消化电泳图

牛乳、羊乳和人乳中的蛋白质在胃肠液中消化电泳图见图4。由图4可见，牛乳、羊乳和人乳在整个胃肠液消化期间，酪蛋白条带逐渐变暗，尤其在消化10 min时，牛乳和羊乳酪蛋白条带逐渐消失，人乳在消化2 min 时，酪蛋白条带也逐渐消失。随着降解产物的形成和消化时间的延长，乳清蛋白条带亮度也逐渐减少。通过对电泳条带灰度扫描发现，牛乳、羊乳和人乳中的蛋白质在整个消化期间，随着消化时间的延长，高分子量蛋白（MW>40）、酪蛋白和低分子量蛋白（MW<20）的残留率逐渐减少（见表6），表明随着胃肠液消化时间的延长，蛋白质的消化率逐渐提高。通过对牛乳、羊乳和人乳比较发现，在消化30 min 时牛乳高分子量蛋白（MW>40）残留率最低，羊乳和人乳无显著性差异（P>0.05），表明牛乳中高分子量蛋白（MW>40）比羊乳和人乳更易消化。从酪蛋白残留率看，整个消化期间，牛乳中酪蛋白残留率最高（P<0.05），人乳中酪蛋白残留率最低（P<0.05），表明人乳中酪蛋白在胃肠液中最易消化，羊乳中酪蛋白比牛乳中酪蛋白更易消化。

表6 牛乳、羊乳和人乳在胃肠液消化中蛋白质的残留率 %

3 结 论

通过对牛乳、羊乳和人乳中的蛋白质组成及消化特性研究发现，牛乳、羊乳和人乳中的蛋白质有较大差别，牛乳中酪蛋白质主要由αs1-酪蛋白和β-酪蛋白组成，羊乳中酪蛋白主要由αs2-酪蛋白和β-酪蛋白组成，人乳中酪蛋白主要由β-酪蛋白组成。牛乳和羊乳中乳清蛋白主要是β-乳球蛋白，而人乳中乳清蛋白主要是α-乳白蛋白。模拟成人胃肠消化表明，乳蛋白主要在肠中消化，人乳中蛋白质在胃肠中最易消化，而羊乳比牛乳更易消化，这为进一步开发利用牛乳和羊乳提供基础。