何海栋，柴秀娟，徐卫华，周颖，许先荣

（浙江省立同德医院 呼吸内科，浙江 杭州 310012）

2019年浙江省癌症中心发布《2015年浙江省肿瘤登记地区恶性肿瘤发病与死亡分析》[1]，结果显示肺癌的发病率和致死率均居榜首，是浙江省肿瘤防治的重中之重。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）占所有原发性肺癌的80%～85%，发病患者多为老年人，确诊时大多已处于中晚期，且肿瘤的转移率、复发率高[2-3]。免疫检查点靶向治疗NSCLC 是当前的研究热点，疗效显著，能延长患者生存期[4-6]。PD-L1 是PD-1 最主要的配体之一，主要表达于免疫淋巴细胞、恶性肿瘤细胞、巨噬细胞等[7-8]。 细胞核相关抗原Ki67 是一种与细胞增殖相关的蛋白，除G0期外，在整个细胞周期中均有表达，可用于反映肿瘤细胞所处周期和增殖状态，与肿瘤的增殖、转移及预后关系密切[9]。当前，NSCLC 的靶向治疗通常以PD-L1、Ki67、CTLA-4 等靶点为主[10-12]。本研究通过检测浙江省立同德医院收治的90 例NSCLC 患者病理组织标本中PD-L1 和Ki67 的表达，探讨PD-L1、Ki67 与NSCLC 患者临床病理特征及预后的关系，为临床治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年11月—2018年11月浙江省立同德医院收治的90 例NSCLC 患者。收集其临床资料，包括年龄、性别、病理分型、肿瘤直径、肿瘤分化程度、淋巴结转移、临床分期等。其中，男性54例，女性36例；年龄26 ～83 岁，平均（60.67±10.87）岁；临床分期： Ⅰ期15 例，Ⅱ期19 例，Ⅲ期32 例，Ⅳ期24 例。纳入标准： 符合《中国原发性肺癌诊疗规范（2015年版）》[13]NSCLC 的诊断标准。排除标准： 术前接受过放化疗；有免疫系统疾病；正在接受免疫相关治疗的患者；临床资料、个人信息不全者。本研究经医院伦理委员会批准，患者或家属均知情同意并签署知情同 意书。

1.2 研究方法

1.2.1 HE 染色HE 染色观察肺组织病变。所有手术切除标本经10%甲醛固定、石蜡包埋、连续切片（厚约4μm）、脱蜡水化。苏木精染色8 min，自来水冲洗至返蓝后盐酸酒精分化，伊红染色1 min、放入TO 型生物制片透明剂中10 min，中性树胶封片，光镜下观察。

1.2.2 免疫组织化学法免疫组织化学SP 法检测肺癌组织中PD-L1 和Ki67 的表达。相关操作均严格按照试剂盒说明书进行，切片3% H2O2修复后加入一抗兔抗人PD-L1 和鼠抗人Ki67，37℃孵育30 min。PBS 冲洗3 次，加入二抗，37℃孵育30 min，DAB 显色。设已知阳性片和阴性对照，HE 染色作组织学对照。单克隆抗体购自德国默克公司。免疫组织化学染色试剂盒、DAB显色剂购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

1.2.3 结果判定由≥2 位病理医师进行结果判定。阳性细胞数≥5%为PD-L1 或Ki67 阳性，无染色或阳性细胞数＜5%为PD-L1 或Ki67 阴性。阳性细胞≤ 25%为低表达，阳性细胞数＞25%为高表达。

1.2.4 随访随访时间截至2019年11月30日。通过电话、信函和查阅医院病案记录等方式随访。所有患者具有完整随访资料。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0 统计软件，计数资料以率（%）表示，比较采用χ2检验；影响因素的分析采用多因素Logistic 回归模型；Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，比较采用Log-rank χ2检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC 患者肺组织中PD-L1、Ki67 的表达

HE 染色结果显示，NSCLC 患者肺组织中细胞较小，细胞核深染，细胞核质比增加，细胞呈弥散状排列（图1A）。免疫组织化学染色结果显示，PD-L1 主要表达于细胞膜（图1B），Ki67 主要表达于细胞核 （图1C）。90 例NSCLC 患者中，PD-L1 阳性62 例（68.89%）， 阴性28 例（31.11%）；Ki67 阳性58 例（64.44%），阴性32 例（35.56%）。

图1 NSCLC 患者肺组织HE 和免疫组织化学染色

2.2 PD-L1、Ki67 与NSCLC 患者临床病理特征的关系

不同病理分型、肿瘤分化程度、淋巴结转移患者的PD-L1 阳性率比较，经χ2检验，差异均有统计学意义（P＜0.05）。鳞癌、低分化、淋巴结转移患者PD-L1 阳性率较高。不同性别、病理分型、肿瘤分化程度患者的Ki67 阳性率比较，经χ2检验，差异均有统计学意义（P＜0.05）。女性、鳞癌、低分化患者Ki67 阳性率较高。见表1。

2.3 NSCLC 患者PD-L1、Ki67 高表达的影响因素

分析PD-L1 高表达的影响因素时，以PD-L1 为因变量，病理分型、肿瘤分化程度、淋巴结转移为自变量，进行多因素Logistic 回归分析；分析Ki67 高表达的影响因素时，以Ki67 为因变量，性别、病理分型、肿瘤分化程度为自变量，进行多因素Logistic 回归分析。鳞癌、腺癌及其他病理分型分别赋值为0、1、2；低、中、高分化分别赋值为0、1、2；有无淋巴结转移分别赋值为0 和1；男性和女性分别赋值为0 和1。结果显示，病理分型[=2.716（95% CI： 1.695，3.375）]、肿瘤分化程度[=3.655（95% CI： 1.737，8.096）]、淋巴结转移[=3.054（95% CI： 1.542，4.116）]是PD-L1 高表达的影响因素；性别[=2.857（95% CI： 1.609，4.641）]、病理分型[=6.171（95% CI： 1.613，9.675）]、肿瘤分化程度[=2.282（95% CI： 1.704，2.957）]是Ki67 高表达的影响因素。见表2。

2.4 PD-L1、Ki67 与NSCLC 患者预后的关系

90 例NSCLC 患者中，失访6 例，死亡38 例。PD-L1 阳性患者2年生存率（48.39%）低于PD-L1阴 性 患 者（78.57%）（χ2=7.204，P=0.007）。其 中PD-L1 阳性患者的中位生存时间为42 周，PD-L1 阴性患者为65 周，经Log-rank χ2检验，差异有统计学意义（χ2=5.672，P=0.011）。Ki67 阳性患者2年生存率（48.27%）低于Ki67 阴性患者（75.00%）（χ2=6.037，P=0.014）。其中Ki67 阳性患者的中位生存时间为41 周，Ki67 阴 性 患 者 为66 周，经Log-rank χ2检验，差异有统计学意义（χ2=8.504，P=0.008）。见 图2、3。

表1 不同临床病理特征患者的PD-L1、Ki67 阳性率比较 例（%）

表2 NSCLC 患者PD-L1、Ki67 高表达的多因素Logistic 回归分析参数

图2 PD-L1 阳性与阴性患者的生存曲线

图3 Ki67 阳性与阴性患者的生存曲线

3 讨论

NSCLC 是原发性肺癌的主要类型，约75%患者在发病时已处于中晚期，大多已错过最佳手术时机[14]。 不同人种、地区、民族之间存在基因的差异性表达。如东亚人和西方人在某些基因的表达上存在差异[15]。PD-L1 是一种跨膜糖蛋白，在病理状态下通过与其受体PD-1 结合，抑制免疫T 淋巴细胞的活化和增殖，参与肿瘤免疫逃逸，促进恶性肿瘤的发生、发展[16]。Ki67 是一种细胞增殖标志物，属于非组蛋白，对蛋白酶敏感性极高，其水平变化会引起信号转导异常，从而参与肿瘤发生、发展过程[17]。

本研究纳入的NSCLC 患者肺癌组织中细胞较小，细胞核深染，细胞核质比增加，细胞呈弥散状排列。PD-L1 主要表达于细胞膜，阳性表达率为68.89%。Ki67 主要表达于细胞核，阳性表达率为64.44%。与其他研究结果大致相似[18-19]。以上结果表明，NSCLC患者肺癌组织中存在PD-L1 和Ki67 高表达。

本研究结果显示，NSCLC 患者的病理分型、肿瘤分化程度、淋巴结转移是PD-L1 高表达的影响因素。鳞癌患者PD-L1 阳性率高于腺癌和其他分型患者，与吴鸿念等[20]的研究结果一致。低分化患者PD-L1 阳性率高于高、中分化患者；淋巴结转移患者PD-L1阳性率高于无淋巴结转移患者，这可能与PD-L1 抑制CD4+和CD8+T 细胞的活化和增殖有关[21]。此外，NSCLC 患者的性别、病理分型、肿瘤分化程度是Ki67 高表达的影响因素。男性患者Ki67 阳性率高于女性；低分化患者Ki67 阳性率高于高、中分化患者，说明Ki67 可能与雌激素的分泌、细胞增殖活跃程度有关[22]。鳞癌患者Ki67 阳性率高于腺癌和其他分型患者，与单彬彬等[23]的研究结果一致。

本研究结果显示，PD-L1 阳性患者2年生存率（48.39%）低于PD-L1 阴性患者，PD-L1 阳性患者的中位生存时间为42 周，低于PD-L1 阴性患者的65 周，说明PD-L1 的表达与患者预后有关。Ki67 阳性患者2年生存率（48.27%）低于Ki67 阴性患者，Ki67 阳性患者的中位生存时间为41 周，低于Ki67 阴性患者的66 周，说明Ki67 的表达与患者预后有关。PD-L1、Ki67 对NSCLC 患者生存率和生存期的估计具有一定指导意义。

综上所述，NSCLC 患者肺癌组织中存在PD-L1和Ki67 高表达。NSCLC 患者的病理分型、肿瘤分化程度、淋巴结转移与PD-L1 高表达有关；NSCLC 患者的性别、病理分型、肿瘤分化程度与Ki67 高表达有关。PD-L1、Ki67 阳性患者预后较差。