黄伟，钱锦锋，蔡执中，姜叶飞

（武警海警总队医院 骨四科，浙江 嘉兴 314000）

脊髓损伤是一种毁灭性的疾病，通常导致患者终身残疾[1]。据统计，全球约有250 万人受脊髓损伤的影响[2]。脊髓损伤后，脊髓回路下行通路断开，导致其失去运动相关突触输入[3]，严重影响患者对运动的控制[4]。目前，脊髓损伤的治疗仍是临床和基础科学研究的最大挑战之一[5]，迫切需要开发新疗法。MicroRNA（miRNA）在多种疾病中起重要调控作用，已有多项研究证实其在脊髓损伤中的表达及功能[6]。WANG 等[7]研究表明，miR-21-5p 介导脊髓损伤后纤维瘢痕的形成，促进脊髓损伤恢复。YANG 等[8]研究表明，少突胶质细胞前体细胞移植可促进大鼠脊髓损伤后的功能恢复，进一步检测发现其功能恢复与miR-375-3p、miR-1-3p、miR-363-3p等表达水平改变有关。ZHAO 等[9]研究表明，miR-124 促进骨髓间充质干细胞分化为神经源性细胞，加速脊髓损伤恢复。miRNA的异常表达被认为与大鼠脊髓损伤功能恢复相关，miR-92a、miR-202、miR-132、miR-451、miR-27b、miR-208、miR-17、miR-128、miR-107、miR-223等被报道在大鼠脊髓损伤组织中表达异常[2，5-6，10-12]。 然而，miRNA 在脊髓损伤后运动功能恢复中的作用报道较少。

本研究复制大鼠脊髓损伤模型，采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）在大鼠脊髓损伤组织中筛选出目标miRNA，进一步研究该miRNA 在大鼠脊髓损伤后运动功能恢复中可能的分子机制，为脊髓损伤的精准治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物6 周龄清洁级雄性Spregue-Dawley大鼠84 只，体重200 ～250 g，动物许可证号： SCXK（京）2011-0001，由昆明医科大学实验动物中心提供。所有实验程序获昆明医科大学动物保护与使用委员会批准。24℃恒温环境饲养，12 h 明暗交替，自由饮水进食。按照随机对照动物实验方法，将84 只实验大鼠随机分为2 批，第一批30 只分为假手术组和脊髓损伤组，每组15 只；第二批54 只分为假手术组、对照组（脊髓损伤+miR-92a mimics negative control）和实验组（脊髓损伤+miR-92a mimics），每组18 只。本实验2017年4月—2018年7月在昆明医科大学科研实验中心完成。

1.1.2 实验细胞大鼠小胶质细胞BV-2（货号： RAT-CELL-0077）购自武汉原生原代生物医药科技有限公司。将细胞置于添加10%胎牛血清、100 u/ml青霉素和链霉素的DMEM/F12 培养基中，37℃、5%二氧化碳条件下常规培养。

1.1.3 主要仪器及试剂倒置显微镜（日本Olympus公司），qRT-PCR 仪（美国赛默飞世尔公司）。多聚甲醇（美国Hyclone 公司），Triton（美国远慕生物公司），TUNEL 染色混合液（瑞士Roche 公司），RIPA 裂解液、BCA 试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），PTEN抗体、Caspase-3 抗体、Bax 抗体、Bcl-2 抗体和β-actin抗体（英国Abcam 公司），Trizol（日本TaKaRa 公司），水合氯醛、TaqMan ™ MicroRNA 逆转录试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司），miR-92a mimics、miR-92a mimics negative control（广州锐博生物科技有限公司），Lipofectamine®2000、双荧光素酶报告基因试剂盒（美国赛默飞世尔公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 复制大鼠脊髓损伤模型第一批大鼠腹腔注射10%水合氯醛（350 mg/kg）麻醉后，脊髓损伤组在T9～T10水平进行椎板切除手术，在不破坏硬脑膜的情况下暴露脊髓，随后夹紧T8和T11的棘突以稳定脊柱，使用纽约大学冲击器[5]对暴露在外的脊髓背侧表面进行挫伤损伤（10 g×25 mm）；假手术组大鼠采用T10椎板切除术，未出现体重下降。

1.2.2 miR-92a mimics 干预第二批实验组大鼠在脊髓损伤后立即髓鞘内注射miR-92a mimics（1μl/h，20 nmol/ml），持续3 d；对照组大鼠脊髓损伤后鞘内注射等量miR-92a mimics negative control，方法同实验组。

1.2.3 BBB 评分评估大鼠术后行为在脊髓损伤后第1、3、7、14、21 和28 天，采用BBB 评分评估大鼠后肢运动功能。评分采用双盲法，由3 位经验丰富的评分人独立完成，最终取3 人评分的均值。

1.2.4 TUNEL 染色检测细胞凋亡情况取脊髓组织切片于室温下固定20 min，PBS 清洗30 min，随后4℃、0.1% Triton X-100 透化2 min。PBS 清洗2 次，加入TUNEL 染色混合液，37℃条件下避光孵育1 h，加入1μg/ml DAPI，室温下避光孵育10 min。清洗后甘油封片，在荧光显微镜下观察细胞凋亡情况。

1.2.5 Western blotting 检测PTEN 和凋亡相关蛋白术后第28 天取脊髓，截取包含损伤中心的1 cm 脊髓段，使用RIPA 裂解液提取脊髓组织或BV-2 细胞中总蛋白。采用BCA 法测定蛋白浓度，配制12%分离凝胶，每个泳道加入30μg 蛋白样品。电泳后，转膜至PVDF 膜上，室温封闭2 h。加入一抗： PTEN 抗体（1∶1 000）、Caspase-3 抗体（1∶1 000）、Bax 抗体（1∶1 000）、Bcl-2 抗体（1∶1 000）、β-actin 抗体（1∶1 000），4℃孵育过夜。次日，加入抗大鼠IgG 辣根过氧化物酶偶联二抗（1∶2 000），4℃孵育90 min。使用UVP 凝胶成像系统成像、Image J 软件分析蛋白条带灰度值，实验重复3 次。

1.2.6 qRT-PCR检测miRNAs 和PTEN mRNA术后第28 天取脊髓，使用Trizol 提取脊髓损伤组织总RNA 并确定总RNA 的纯度和浓度，使用逆转录试剂盒将miRNAs 和PTEN mRNA 逆转录为cDNA，取适量cDNA 配置PCR 反应体系，miRNAs 以U6 为内参，PTEN mRNA 以GAPDH 为内参，引物序列见表1。实验重复3 次，采用2-△△Ct法计算基因相对表达量。

1.2.7 双荧光素酶报告基因验证miR-92a 与PTEN的靶向关系构建包含miR-92a 和PTEN-3' UTR 结合位点的PTEN-3' UTR（PTEN-WT），以及不含该结合位点的PTEN-3' UTR（PTEN-MUT）载体质粒。将BV-2 细胞接种于24 孔板中（2×105个/孔），使用Lipofectamine 2000 试剂共转染，分为对照组（载体质粒+miR-92a mimics negative control）和实验组（载体质粒+miR-92a mimics）。转染48 h 后测定荧光素酶活性，实验重复3 次。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用t检验或单因素方差分析或重复测量设计的方差分析，方差分析的两两比较用LSD-t检验；相关性分析用Pearson 法，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠脊髓损伤模型评估

脊髓损伤组与假手术组大鼠第1、3、7、14、21、28 天BBB 评分比较，采用重复测量设计的方差分析，结果： ①不同时间点的BBB 评分有差异（F=103.273，P=0.000）；②假手术组与脊髓损伤组的BBB 评分有差异（F=93.474，P=0.000），假手术组BBB 评分较高；③两组BBB 评分变化趋势有差异（F=59.057，P=0.000）。见表2。

脊髓损伤组与假手术组大鼠细胞凋亡率比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3和图1。

脊髓损伤组与假手术组大鼠Caspase-3、Bax、Bcl-2 相对表达量比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3和图2。

表2 两组大鼠各时间点BBB 评分比较 （n =15，±s）

表2 两组大鼠各时间点BBB 评分比较 （n =15，±s）

组别 第1 天 第3 天 第7 天 第14 天 第21 天 第28 天脊髓损伤组 1.07±0.33 3.95±1.35 6.23±1.97 11.41±4.02 12.28±4.27 12.87±4.55假手术组 20.32±6.65 17.04±5.61 24.18±7.89 16.73±5.17 18.86±6.28 18.32±5.98

表3 两组大鼠细胞凋亡率及Caspase-3、Bax、Bcl-2 表达水平比较 （n =15，±s）

表3 两组大鼠细胞凋亡率及Caspase-3、Bax、Bcl-2 表达水平比较 （n =15，±s）

组别 细胞凋亡率/% Caspase-3 Bax Bcl-2脊髓损伤组 29.37±4.42 2.86±0.72 2.25±0.56 2.04±0.52假手术组 16.18±3.07 1.94±0.51 1.62±0.41 3.85±0.97 t 值 9.493 4.038 3.516 6.369 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

图1 两组大鼠脊髓组织中细胞凋亡情况（TUNEL 染色×200）

2.2 大鼠脊髓组织中miRNAs 的异常表达

脊髓损伤组与假手术组大鼠miR-92a、miR-132、miR-128、miR-107、miR-17、miR-202、miR-451表达水平比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05）；miR-27b、miR-208、miR-223 表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4和图3。

图2 两组凋亡相关蛋白相对表达量比较 （n =15，±s）

表4 两组大鼠脊髓组织中miRNAs 的表达水平比较 （n =15，±s）

表4 两组大鼠脊髓组织中miRNAs 的表达水平比较 （n =15，±s）

组别 miR-92a miR-132 miR-128 miR-107 miR-27b miR-17 miR-208 miR-223 miR-202 miR-451脊髓损伤组-4.03±1.12 -3.25±1.08 -2.84±1.02 -2.21±1.02 -1.06±0.34 1.79±0.98 1.11±0.36 1.14±0.37 3.39±1.24 4.12±1.55假手术组 -1.04±0.32 -1.02±0.31 -1.03±0.32 -1.03±0.31 -1.03±0.33 1.09±0.37 1.09±0.35 1.10±0.35 1.08±0.35 1.10±0.37 t 值 9.942 7.687 6.558 4.287 0.245 2.366 0.154 0.304 6.944 7.340 P 值 0.000 0.000 0.000 0.001 0.808 0.030 0.879 0.763 0.000 0.000

图3 两组大鼠脊髓组织中miRNAs 表达水平比较 （n =15，±s）

2.3 miR-92a 促进大鼠脊髓损伤运动功能恢复并抑制细胞凋亡

假手术组、对照组、实验组大鼠第1、7、14 和28 天的miR-92a 表达水平比较，采用重复测量设计的方差分析，结果： ①不同时间点的miR-92a 表达水平有差异（F=78.341，P=0.000）；②3 组miR-92a 表达水平有差异（F=53.409，P=0.000），实验组miR-92a表达水平最高（P＜0.05）；③3 组miR-92a 表达水平变化趋势有差异（F=31.351，P=0.000）。见表5。

假手术组、对照组、实验组大鼠第1、3、7、14、21 和28 天的BBB 评分比较，采用重复测量设计的方差分析，结果： ①不同时间点的BBB 评分有差异（F=44.751，P=0.000）；②3 组BBB 评分有差异（F=76.832，P=0.000），假手术组BBB 评分最高（P＜0.05）；③3 组BBB 评分变化趋势有差异（F=52.059，P=0.000）。见表6。

表5 3 组大鼠各时间点miR-92a 表达水平比较 （n =18，±s）

表5 3 组大鼠各时间点miR-92a 表达水平比较 （n =18，±s）

组别 第1 天 第7 天 第14 天 第28 天假手术组 0.96±0.31 0.83±0.24 0.92±0.29 0.77±0.23对照组 0.95±0.31 0.96±0.31 0.95±0.32 0.96±0.33实验组 0.97±0.32 1.94±0.65 3.94±1.31 2.86±0.98

表6 3 组大鼠各时间点BBB 评分比较 （n =18，±s）

表6 3 组大鼠各时间点BBB 评分比较 （n =18，±s）

组别 第1 天 第3 天 第7 天 第14 天 第21 天 第28 天假手术组 20.32±6.65 17.04±5.61 24.18±7.89 16.73±5.17 18.86±6.28 18.32±5.98对照组 0.96±0.32 2.58±0.86 4.18±1.36 7.32±2.37 9.25±3.08 10.84±3.62实验组 0.95±0.31 3.04±1.01 7.13±2.34 11.43±3.84 12.84±4.28 14.27±4.35

3 组大鼠细胞凋亡率比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=23.015，P=0.000）；对照组高于假手术组和实验组。见表7和图4。

3 组大鼠Caspase-3、Bax、Bcl-2 水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=26.909、33.417 和29.053，均P=0.000）；对照组Caspase-3、Bax 高于假手术组和实验组，Bcl-2 低于假手术组和实验组。见表7和图5。

表7 3 组大鼠细胞凋亡率及Caspase-3、Bax、Bcl-2 表达水平比较 （n =18，±s）

表7 3 组大鼠细胞凋亡率及Caspase-3、Bax、Bcl-2 表达水平比较 （n =18，±s）

组别 细胞凋亡率/% Caspase-3 Bax Bcl-2假手术组 16.18±3.07 1.94±0.51 1.62±0.41 3.66±0.91对照组 64.91±9.77 3.49±0.87 3.68±0.92 1.37±0.39实验组 21.38±7.14 2.17±0.54 1.64±0.41 2.04±0.52 F 值 23.015 26.909 33.417 29.053 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

图4 3 组大鼠脊髓组织中细胞凋亡情况 （TUNEL 染色×200）

图5 3 组大鼠凋亡相关蛋白相对表达量比较 （n =18，±s）

2.4 PTEN 是miR-92a 的靶基因

对照组与实验组大鼠PTEN-WT 荧光活性比较，经t检验，差异有统计学意义（t=4.816，P=0.000），实验组低于对照组；两组PTEN-MUT 荧光活性比较，差异无统计学意义（t=0.173，P=0.864）。见表8。

对照组与实验组大鼠PTEN mRNA 和蛋白相对表达量比较，经t检验，差异有统计学意义（t=5.654和3.058，P=0.000 和0.004），实验组低于对照组（见表8和图6）。PTEN 与miR-92a 表达水平呈负相关（r=-0.876，P=0.000）（见图7）。

表8 两组大鼠PTEN-WT 和PTEN-MUT 荧光活性以及PTEN mRNA 和蛋白相对表达量比较 （n =18，±s）

表8 两组大鼠PTEN-WT 和PTEN-MUT 荧光活性以及PTEN mRNA 和蛋白相对表达量比较 （n =18，±s）

组别 PTEN-WT 荧光活性 PTEN-MUT 荧光活性 PTEN mRNA PTEN 蛋白对照组 1.09±0.52 1.11±0.53 3.02±0.54 1.36±0.51实验组 0.43±0.26 1.08±0.51 2.10±0.43 0.91±0.36 t 值 4.816 0.173 5.654 3.058 P 值 0.000 0.864 0.000 0.004

图6 两组大鼠PTEN 蛋白相对表达量比较 （n =18，±s）

3 讨论

脊髓损伤常导致患者运动功能受损，严重时可导致残疾、瘫痪甚至死亡[13]。然而，目前尚未有一种疗法可以有效地阻止脊髓损伤的发展进程[14]。近年来，对miRNAs 的研究提示其可能在脊髓损伤恢复中扮演着重要角色[15]，为脊髓损伤恢复的分子机制研究提供了新思路。YU 等[16]研究表明，miR-133b 在成年斑马鱼脊髓损伤组织中高表达，对其脊髓损伤后的功能恢复至关重要。miR-133b 靶向轴突生长抑制剂RhoA，使用吗啉反义寡核苷酸抑制miR-133b 的表达，导致脊髓损伤的成年斑马鱼运动功能恢复，NMLF、SRF和IMRF 神经元轴突减少。YI 等[17]研究表明，miR-155 缺乏会抑制Th17 细胞分化，促进脊髓损伤后的运动功能恢复。BHALALA 等[18]研究表明，小鼠脊髓损伤后，miR-21 呈时间依赖性升高，病变区域的星形胶质细胞表达高水平miR-21。敲除miR-21 可促进脊髓损伤后胶质瘢痕形成，从而促进脊髓损伤恢复。WANG 等[19]研究表明，cAMP 是3 条参与坐骨神经损伤调节、促进神经突触生长的信号通路的上游调控因子。miR-142-3p 可通过AC9 诱导cAMP 升高，促进神经突生长，有助于脊髓损伤后的感觉功能恢复。本研究发现miR-92a 在大鼠脊髓损伤组织中低表达，过表达miR-92a 有助于脊髓损伤大鼠运动功能恢复并抑制细胞凋亡。

PTEN 作为一个脊髓损伤后负调节因子，可抑制脊髓损伤后的神经新生[20]和轴突再生[21]，同时PTEN在细胞增殖、凋亡和神经元分化方面也发挥重要作用。YAN 等[22]研究表明，PTEN通过激活Wnt/β-catenin通路，抑制胰腺炎细胞增殖和迁移。MATSUDA 等[23]报道，过表达PTEN 通过抑制PI3K/Akt 信号通路，抑制细胞凋亡。LEE 等[24]研究表明，PTEN 可通过抑制ERK 信号与S6K 信号的相互作用，促进神经元分化。有研究表明，PTEN 在脊髓损伤组织中高表达[25]，敲除PTEN可促进脊髓损伤大鼠的运动功能恢复[26-27]。HU等[28]研究表明，miR-21 靶向PTEN 抑制脊髓损伤大鼠细胞凋亡。本研究发现，PTEN是miR-92a 的一个靶基因，在大鼠脊髓损伤组织中表达上调。大鼠脊髓损伤组织中，PTEN 与miR-92a 表达水平呈负相关。

综上所述，miR-92a 可能通过调节PTEN 促进大鼠脊髓损伤后的运动功能恢复。PTEN是miR-92a的靶基因，miR-92a 可能通过调节PTEN 从而促进大鼠脊髓损伤后运动功能恢复。受实验设备、研究时长等因素影响，本研究有不足之处，后期将进一步 完善。