王立成，李现铎，陈冬冬，唐冠宝，门同义

（山东大学附属千佛山医院 泌尿外二科，山东 济南 250014）

肾间质纤维化是各种慢性肾脏疾病终末期的共同病变过程。因肾小管上皮-间质细胞转化，正常的肾脏结构被细胞外基质（extracellular matrix,ECM）替代。KLF-4 抑制多种细胞上皮-间质细胞转化，调控肾纤维化发展进程[1-5]。研究发现，MicroRNA（miRNA）是纤维化发生、发展过程中细胞生物学功能的主要调控者[6-8]。本研究旨在分析miR-381 与KLF-4 在肾纤维化发展进程中的调控关系，为诊断及治疗肾纤维化提供新的研究方向。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年2月—2017年12月山东大学附属千佛山医院收治的106 例肾纤维化患者。其中，男性59 例，女性47 例；平均年龄（53.42±12.15）岁。所有患者无泌尿系感染、糖尿病及恶性肿瘤。收集同期本院健康体检者100 例作为对照组。其中，男性50 例，女性50 例；平均年龄（52.35±10.33）岁。

1.2 外周血采集

采用美国BD 公司一次性血清分离胶管，所有纳入患者及健康体检者于清晨空腹状况下抽取外周静脉血约3 ml，静置。待血清析出后，使用台式离心机以1 500 r/min 离心10 min，取上层血清，冻存至-80℃冰箱待检测。

1.3 实时荧光定量聚合酶链反应

采用美国Invitrogen 公司Trizol 试剂盒提取总RNA，将提取到的总RNA 按照逆转录试剂盒说明书进行RNA 逆转录，合成cDNA。应用美国ABI 公司StepOne Plus 实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）仪，严格按照日本TaKaRa 公司SYBR Premix Ex Taq PCR 反应试剂盒的操作说明书进行PCR 反应。

1.4 细胞培养和转染

NRK49F 细胞购自中国科学院上海细胞库，在10%磷酸盐缓冲液（PBS）的DMEM-LG 培养基中，37℃、95%空气、5%二氧化碳的细胞恒温培养箱中孵育培养。当细胞生长至覆盖率达85%时，进行细胞传代。传代过程中，弃去原DMEM-LG 培养基，无菌PBS 洗3 次，再用0.25%胰酶消化1 min。在倒置显微镜下观察细胞消化过程，待细胞变圆、边缘变亮后，加入含10% PBS 的DMEM 培养基终止消化并将细胞按照1∶3 的比例进行传代。将细胞分为miR-381 组、NC 组、Ang Ⅱ组、空白组。miR-381 组按照说明书将miR-381mimics 转染进NRK49F 细胞；NC组按照说明书将negative control miRNA mimics 转染进NRK49F细胞；AngⅡ组将AngⅡ作用于NRK49F细胞；空白组未做任何处理。

1.5 荧光素酶报告分析

构建KLF-4 野生型3’-UTR 荧光素酶报告基因质粒pMIR-WT，并以pMIR-WT 质粒为模板，利用PCR 搭桥法构建其潜在结合位点突变型报告基因质粒pMIR-MUT。用pMIR-WT 或pMIR-MUT 分别转染miR-381 组和NC 组NRK49F 细胞。在细胞培养箱中培养36 h 后，用Passive lysis buffer 裂解细胞后分析双荧光素酶活性。

1.6 Western blotting

弃去培养皿中DMEM 细胞培养液，以预冷的无菌PBS 清洗细胞3 次，弃去PBS，向培养皿中加入蛋白裂解液200μl，充分震荡，用细胞刮收集细胞至1.5 ml EP 管中，4℃、15 000 r/min 离心10 min，上清液即为细胞全蛋白。通过聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，按说明书进行Western blotting 检测。

1.7 复制单侧输尿管梗阻小鼠模型

24 只BACB/c 小鼠，雌雄不限，鼠龄6 ～8 周，体重18 ～20 g，由山东大学附属千佛山医院动物实验中心提供，动物许可证号： SYXK（鲁）20180009。将24 只小鼠随机分为假手术组、单侧输尿管梗阻（UUO）组及UUO+miR-381 组，每组8 只。小鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.004 ml/g）麻醉约2 min 后，取仰卧位固定。术前消毒，于无菌条件下，取腹部正中白线为手术切口。UUO 组和UUO+miR-381 组寻找左侧输尿管并钝性分离输尿管至肾门，于小鼠肾脏下极和肾门处分别用丝线结扎左侧输尿管，并于两结扎处之间剪断输尿管。右侧输尿管不予任何处理，缝合腹膜，消毒，缝合腹直肌和皮肤，再次消毒。假手术组小鼠除不结扎输尿管外，其余操作与上述相同。UUO+miR-381 组尾静脉注射40 mg/kg miR-381mimics 1 次/3 d，假手术组和UUO 组尾静脉注射等量生理 盐水。

1.8 Masson 染色

切取小鼠肾脏标本并用固定液固定，浸蜡包埋，固定于切片机上切成3 ～5μm 薄片，按照说明书分别采用苏木精-伊红染色和Masson 染色对3 组小鼠肾脏纤维化进行分析。

1.9 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用独立样本t检验或单因素方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-381 在肾纤维化患者及小鼠UUO 模型体内的表达

qRT-PCR 结果表明，miR-381 在肾纤维化患者、对照组血清中的相对表达量分别为（0.324±0.047）和（1.000±0.122），经t检验，差异有统计学意义（t=53.035，P=0.000），肾纤维化患者低于对照组。UUO 组、假手术组小鼠肾脏组织中miR-381 相对表达量分别为（0.417±0.062）和（1.000±0.208），经t检验，差异有统计学意义（t=12.030，P=0.000），UUO组低于假手术组。

2.2 Ang Ⅱ抑制NRK49F 细胞中miR-381 的表达

Ang Ⅱ组和空白组miR-381 相对表达量分别为（0.324±0.047）和（1.000±0.122），经t检验，差异有统计学意义（t=53.035，P=0.000），经Ang Ⅱ刺激后miR-381 在NRK49F 细胞的相对表达量低于 空白组。

2.3 miR-381 抑制α-SMA 的表达

miR-381 组、Ang Ⅱ组、空白组α-SMA 相对表达量为（0.762±0.089）、（1.127±0.154）、（0.519± 0.073），经方差分析，差异有统计学意义（F=7.321，P=0.023），AngⅡ组高于miR-381组和空白组（t=3.554和6.179，P=0.024 和0.004）。

2.4 KLF-4 是miR-381 的靶基因

通过miRNA 靶基因数据库Targetscan 进行筛选预测，确定miR-381 的潜在靶基因为KLF-4（见图1）。双荧光素酶检测结果显示，miRNA-381 组与NC 组pMIR-WT 荧光活性分别为（0.437±0.043）和（1.000±0.126），经t检验，差异有统计学意义（t=7.324，P=0.002），miRNA-381 组低于NC 组；miRNA-381 组与NC 组pMIR-MUT 荧光活性分别为（0.951±0.012）和（1.121±0.164），差异无统计学意义（t=1.791，P=0.148）。miR-381 可结合KLF-4 的3'-UTR 并抑制KLF-4的表达。

2.5 miR-381 负向调控KLF-4 mRNA 和蛋白的表达

qRT-PCR 结果显示，miR-381 组、NC 组KLF-4 mRNA 相对表达量分别为（0.335±0.029）和（1.000± 0.174），经t检验，差异有统计学意义（t=6.530，P=0.003），miR-381 组低于NC 组。

Western blotting 检测结果显示，miR-381 组、NC组KLF-4 蛋白相对表达量分别为（0.166±0.074）和（0.385±0.049），经t检验，差异有统计学意义（t=4.274，P=0.013），miR-381 组低于NC 组（见图2）。miR-381 能靶向调控KLF-4，且抑制KLF-4 mRNA 和蛋白的表达。

图1 miR-381 与靶基因KLF-4 的序列关系

图2 两组KLF-4 蛋白的表达

2.6 miR-381 抑制肾纤维化因子mRNA 的表达

NC 组与miR-381 组肾纤维化因子α-SMA、CTGF、COL1A1 及COL3A1 mRNA 相对表达量比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05），miR-381 组均低于NC 组。miR-381 能干扰TGF-β 信号通路，从而抑制肾纤维化的发展进程。见表1。

表1 两组肾纤维化因子mRNA 的相对表达量比较 （±s）

表1 两组肾纤维化因子mRNA 的相对表达量比较 （±s）

组别 α-SMA mRNA CTGF mRNA COL1A1 mRNA COL3A1 mRNA NC 组 1.000±0.162 1.000±0.117 1.000±0.134 1.000±0.091 miR-381 组 0.614±0.076 0.403±0.054 0.482±0.082 0.267±0.045 t 值 3.736 8.025 5.711 12.506 P 值 0.020 0.001 0.005 0.000

2.7 miR-381 抑制UUO 小鼠肾纤维化发展进程

Masson 染色发现，相比UUO 组，UUO+miR-381组小鼠肾纤维化区域减小，ECM 沉积变少（见图3）。各组COL1A1 和COL3A1 mRNA 相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较经LSD-t检验，UUO+miR-381 组低于UUO 组（t=5.340 和5.992，P=0.006 和0.004）。miR-381 抑制UUO 小鼠的肾纤维化发展进程。见表2。

表2 3 组小鼠COL1A1 和COL3A1 mRNA 相对表达量比较 （n =8，±s）

表2 3 组小鼠COL1A1 和COL3A1 mRNA 相对表达量比较 （n =8，±s）

组别 COL1A1 mRNA COL3A1 mRNA假手术组 1.117±0.025 1.565±0.038 UUO 组 4.165±0.791 4.854±0.657 UUO+miR-381 组 1.649±0.201 2.411±0.259 F 值 10.023 9.327 P 值 0.004 0.005

图3 miR-381 对肾纤维化的调控 （Masson 染色×100）

3 讨论

肾间质纤维化是肾脏病变的病理基础和最终途径，其在多因素作用下，引起炎症浸润、成纤维细胞增生及ECM 在肾间质沉积[9]，是肾衰竭特征之一。miRNA 是一类非编码单链小分子RNA，可调控人体30%编码蛋白基因的表达。左琪等[10]发现，相对于无肾间质纤维化患者，肾间质纤维化患者尿中miR-21 升高，干预治疗后miR-21 下降，纤维化程度减轻。刘亚楠等[11]在UUO 大鼠模型中发现miR-192 在纤维化中起促进作用。miRNA 靶点治疗可以抑制或阻断纤维化，避免肾脏替代治疗。已有报道证实，miRNA与肾间质纤维化密切相关，但miR-381 在肾间质纤维化中的作用鲜有报道。本研究发现，肾间质纤维化患者血清miR-381 低于对照组，且在UUO 组小鼠肾组织中miR-381 低于假手术组。由此推断，miR-381 可能参与肾间质纤维化发展进程。

肾损伤时，Ang Ⅱ及其受体在成纤维细胞、系膜细胞中表达上调，刺激成纤维细胞增殖，促使ECM 生成及生长因子分泌，发挥促纤维化作用。α-SMA 表达升高标志上皮细胞向肌成纤维细胞转化，使肾间质中肌成纤维细胞聚集，导致ECM 合成和分泌增多，促进纤维化形成。本研究通过Ang Ⅱ刺激NRK49F 细胞，发现Ang Ⅱ组miR-381 低于空白组，且α-SMA 高于空白组，但miR-381 组α-SMA 低于Ang Ⅱ组，表明Ang Ⅱ促进NRK49F 细胞中α-SMA 的表达，该作用可被miR-381 抑制。由结果得知miR-381 可抑制α-SMA 表达及Ang Ⅱ诱导的肾间质纤维化。

KLF 家族主要在胃肠道和其他上皮组织终末期细胞中高表达，参与调节正常细胞分化增殖。KLFs 可作为转录激活子，或转录抑制子，有些KLF 因子兼有两种功能。研究发现，KLF-4 是调节上皮细胞-间质细胞转化的关键负性调控蛋白[12]。本研究通过miRNA靶基因数据库预测KLF-4是miR-381 潜在靶基因，采用双荧光素酶检测发现miR-381 可抑制KLF-4 的表达，并通过实验验证miR-381 可抑制KLF-4 mRNA和蛋白的表达。

CTGF 与肾脏、肺和肝脏等组织器官纤维化进程有关，其在肾脏含量最高。CTGF 是TGF-β 促纤维化信号通路下游因子，刺激细胞增殖及ECM 形成，促进肾间质纤维化[13-14]。ECM 主要成分包括Ⅰ、Ⅲ型胶原，COL1A1 和COL3A1 分别是Ⅰ、Ⅲ型胶原的组成部 分[15]。本研究发现，miR-381 组肾纤维化因子mRNA表达低于NC 组，说明miR-381 抑制KLF-4 表达，并干扰TGF-β 信号通路，抑制肾间质纤维化发展进程。Masson 染色显示UUO+miR-381 组小鼠肾间质纤维化区域小于UUO 组，ECM 沉积变少，纤维化进程受到抑制。UUO+miR-381 组小鼠COL1A1 和COL3A1 mRNA 低于UUO 组，表明miR-381 可抑制UUO 小鼠肾间质纤维化发展进程。

综上所述，miR-381 可抑制Ang Ⅱ诱导的肾间质纤维化，并下调肾纤维化基因表达。抑制UUO 小鼠肾间质纤维化，提示miR-381 抑制KLF-4 表达，干扰TGF-β 信号通路，抑制肾间质纤维化发展进程。因此，miR-381 可能成为肾间质纤维化诊断及治疗的新 靶点。