宋雨茜，李鑫，周高雅，王珊

（1.中南大学化学化工学院 制药工程系，湖南 长沙 410083；2.湖南省脑科医院神经内科，湖南 长沙 410007）

脑胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤[1]。硫酸乙酰肝素（heparan sulfate,HS）是由重复的葡萄糖胺和己糖醛酸残基组成的二糖单元[2]。1 个或多个HS 链以共价键方式与核心蛋白结合形成的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）[3]是细胞外基质的主要组成部分。HS 链可与生长因子、趋化因子、成形素等多种细胞外调节蛋白相互作用，在脑胶质瘤的生长、侵袭及血管生成中发挥重要作用。然而HS 在脑胶质瘤患者肿瘤细胞和血管内皮细胞的表达水平及与预后的关系尚未见报道。本研究选用171 例脑胶质瘤患者的组织芯片，检测HS在脑胶质瘤患者肿瘤细胞和血管内皮细胞的表达水平，分析其与患者临床病理特征及预后的关系。

1 资料与方法

1.1 材料与试剂

人脑胶质瘤组织芯片HBraG171Su01 购自上海芯超生物科技有限公司，包含171 例脑胶质瘤患者的肿瘤组织，所有脑胶质瘤患者临床病理资料完整。根据世界卫生组织（WHO）中枢神经系统肿瘤分级标准，将脑胶质瘤分为Ⅰ～Ⅳ级[4]。其中，Ⅰ级20 例，Ⅱ级79 例，Ⅲ级51 例，Ⅳ级21 例。

HS 鼠单克隆抗体购自美国Amsbio 公司，免疫组织化学试剂盒和DAB 显色试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司，苏木精购自美国Sigma 公司。

1.2 方法

组织芯片采用免疫组织化学Envision 二步法染色。首先对组织芯片常规脱蜡、水化，用柠檬酸修复液进行抗原修复后自然冷却、封闭，取出片子，用PBS 冲洗3 次，滴加1∶1 000 稀释的HS 抗体，于4℃冰箱过夜孵育。用标记辣根过氧化物酶的鼠二抗在室温下孵育45 min，DAB 试剂盒显色后在流动的自来水下冲洗5 min。最后用苏木精复染5 s，自来水下冲洗5 min，室温晾干后用中性树胶固定、封片。为证明HS 抗体对免疫组织化学染色的特异性，以鼠IgG 为空白对照进行染色，结果为阴性。用PBS 代替一抗对HS 阳性的片子进行染色，结果为阴性。

1.3 判断标准

结果的判读采用双盲法。聘请2 位病理学专家对组织芯片的免疫组织化学结果进行评分。①根据HS在肿瘤细胞、血管内皮细胞的染色强度分别进行评分： （-）阴性为0 分，（+）弱阳性为1 分，（++）阳性为2 分， （+++）强阳性为3 分。②根据染色阳性率进行评分： 0%为0 分，＞0%～25%为1 分，＞25%～50%为2 分， ＞50%～75%为3 分，＞75%为4 分。最终总评分为染色强度评分与染色阳性率评分的乘积[5]。总评分≤ 4 分为HS 低表达，总评分＞4 分为HS 高表达。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0 统计软件。计数资料以构成比或率（%）表示，比较用χ2检验；采用Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，比较用Log-rank χ2检验；影响因素的分析用Cox 比例风险回归模型，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HS 在脑胶质瘤组织中的表达

免疫组织化学染色结果显示，HS 的阳性表达定位于肿瘤细胞和血管内皮细胞，且HS 在脑胶质瘤组织血管内皮细胞的染色程度及范围随肿瘤分级升高而加深或扩大。见图1。

2.2 HS 与脑胶质瘤患者临床病理特征的关系

图1 不同肿瘤分级脑胶质瘤患者肿瘤组织中HS 的表达 （免疫组织化学染色×200）

不同年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤分级、生存状态的脑胶质瘤患者肿瘤细胞中HS 的表达水平比较，经χ2检验，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见 表1。

不同肿瘤位置、肿瘤分级、生存状态的脑胶质瘤患者血管内皮细胞HS 表达水平比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。不同年龄、性别的脑胶质瘤患者血管内皮细胞HS 表达水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.3 HS 表达与脑胶质瘤患者生存时间的关系

脑胶质瘤组织肿瘤细胞中HS 表达水平不同的患者的生存时间比较，经Log-rank χ2检验，差异无统计学意义（χ2=0.432，P=0.510）。脑胶质瘤组织血管内皮细胞中HS 表达水平不同的患者的生存时间比较，差异有统计学意义（χ2=18.820，P=0.000），脑胶质瘤组织血管内皮细胞HS 表达水平越高，总生存期越短。见图2。

以脑胶质瘤患者是否死亡为因变量，以其他参数为自变量，其中年龄＞35 岁、男性、肿瘤位置为额叶、病理分级Ⅰ级、肿瘤细胞HS 高表达、血管内皮细胞HS 高表达赋值为1。逐步多因素Cox 比例风险回归分析结果显示，HS 在脑胶质瘤组织血管内皮细胞中高表达和肿瘤分级高是脑胶质瘤患者生存时间的影响因素（P＜0.05）。见表2。

表1 不同临床病理特征脑胶质瘤患者的HS 表达水平比较 例（%）

图2 不同HS 表达水平脑胶质瘤患者的生存曲线

表2 脑胶质瘤患者生存时间的多因素Cox 比例风险回归分析参数

3 讨论

HS 与核心蛋白结合，以HSPG 的方式出现在细胞膜和细胞外基质表面，HS 链是细胞与细胞、细胞与细胞外基质相互作用的重要调节者。HS 链的硫酸化序列对HS 链与生长因子、细胞因子、蛋白质的相互作用有影响[6]。在肿瘤微环境中，高度硫酸化的HS 链通过与血管生成因子、成纤维细胞生长因子2 （fibroblast growth factor 2,FGF2）、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF）、血管生成素1 等 促血管生成因子结合，激活下游信号通路，促进肿瘤血管生成，进一步加速肿瘤的生长和转移[7]。有研究发现，HS 链特异性结构或组成变化都会影响肿瘤生长[8]。在黑色素瘤中，高度硫酸化的HS 链促进FGF2 生成，刺激细胞增殖。HS 链与HGF、血小板释放生长因子、脂蛋白脂肪酶的结合都依赖于HS链的6-O-硫酸化[9]。作用于HS 链生物合成和降解途径中的酶可调节胚胎发育和组织稳态过程，对肿瘤发展也有重要调控作 用[10]。硫酸酯酶1（SULF1）和硫酸酯酶2（SULF2）可特异性切掉6-O-硫酸盐，影响FGF2、细胞外基质、HGF、胶质瘤细胞释放的神经营养因子等生长因子与HS 结合，并发生相互作用，从而影响肿瘤生长的信号通路[11]。已证实SULF2 在胶质瘤组织高表达，并通过调节HSPG 依赖的受体酪氨酸激酶信号通路，促进肿瘤的增殖[12]。

有研究结果表明，HS 主要在胶质母细胞瘤的肿瘤细胞中表达，只有少数几个组织样本在细胞外有HS 表达，且HS 主要出现在坏死区域或腺性结构边界，与细胞类型无关[13]。事实上，除了肿瘤组织，HS 在脑血管系统亦有表达[14]。鉴于血管增生在肿瘤发生、发展中的重要作用，本实验检测了HS 在肿瘤细胞和血管内皮细胞的表达水平，发现肿瘤细胞HS 表达水平与脑胶质瘤的恶性程度无关，但血管内皮细胞HS 表达水平与脑胶质瘤恶性程度有关，提示血管内皮细胞HS 的表达可能参与脑胶质瘤的发生、发展，可能是反映脑胶质瘤恶性程度的重要指标。此外，本研究结果表明脑胶质瘤患者血管内皮细胞HS 表达水平越高，总生存期越短，且HS 在血管内皮细胞中高表达是脑胶质瘤患者总生存期的影响因素，而肿瘤细胞HS 表达水平与脑胶质瘤的恶性程度无关。

综上所述，血管内皮细胞的HS 可能在脑胶质瘤的发生、增殖、侵袭及转移中发挥重要作用，但其作用机制尚需进一步探讨。