浙贝母UPLC-Q-TOF-MS/MS指纹图谱的建立及其抗炎质量标志物的分析

2020-09-21程斌周爱珍彭昕王昕蕾王娟

中国药房 2020年17期

程斌周爱珍彭昕王昕蕾王娟

摘要目的：建立浙貝母超高效液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱（UPLC-Q-TOF-MS/MS）指纹图谱，并确定其抗炎质量标志物。方法：色谱柱为Eclipse Plus C18，流动相为甲醇-0.1%甲酸水溶液（梯度洗脱），流速为0.4 mL/min，柱温为30 ℃，进样量为2 ?L;采用电喷雾离子源，以正、负离子模式检测，在质荷比（m/z）50～1 200范围内进行扫描。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004A版）建立10批不同产地浙贝母的UPLC-Q-TOF-MS/MS指纹图谱。以小鼠耳肿胀度和血清中丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）水平为抗炎指标，采用双变量相关分析法和灰色关联度分析法对浙贝母指纹图谱中各共有峰相对峰面积与抗炎指标的相关性进行分析，筛选质量标志物并进行结构鉴定。结果：在正、负离子模式下，10批浙贝母药材分别各有共有峰26、10个。综合双变量相关分析和灰色关联度分析结果，共发现与抗炎作用相关的质量标志物9个，经鉴定分别为贝母素乙、贝母素甲、环巴胺、胡萝卜苷、Polyphyllin Ⅴ、苦鬼臼毒素、植物甾醇、Ent-kaur-15-en-17-ol、Ent-17-norkauran-16-one。结论：所建立的UPLC-Q-TOF-MS/MS指纹图谱可用于评价浙贝母药材的质量;贝母素乙、贝母素甲、环巴胺等可能是浙贝母具有抗炎作用的质量标志物。

关键词浙贝母;抗炎作用;超高效液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱;双变量相关分析;灰色关联度分析;质量标志物

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish UPLC-Q-TOF-MS/MS fingerprint of Fritillaria thunbergii， and to define its anti-inflammatory quality markers. METHODS： The determination was performed on Eclipse Plus C18 column with mobile phase consisted of methanol-0.1% formic acid solution （gradient elution） at the flow rate of 0.4 mL/min. The column temperature was set at 30 ℃， and injection volume was 2 ?L. The electrospray ion source was used to scan in the range of m/z 50-1 200 with positive and negative ion detection mode. UPLC-Q-TOF-MS/MS fingerprints of 10 batches of F. thunbergii from different habitats were established by using the Similarity Evaluation System of TCM Chromatographic Fingerprints （2004A edition）. With ear swelling degree， the serum levels of MDA and NO as anti-inflammatory indexes， the correlation between the relative area of common peaks in fingerprint and the anti-inflammatory indexes was analyzed by using bivariate correlation analysis and grey correlation analysis， and the quality markers were screened and identified. RESULTS： In positive and negative ion mode， 10 batches of F. thunbergii had 26 peaks and 10 peaks. Based on bivariate correlation analysis and grey correlation analysis， nine quality markers related to anti-inflammatory effect were found， which were identified as peiminine， peimine， cyclobalamine， daucidin， polyphyllin Ⅴ， bitumen podophyllotoxin， phytosterol， ent-kaur-15-en-17-ol， ent-17-norkauran-16-one. CONCLUSIONS： Established UPLC-Q- TOF-MS/MS fingerprint can be used to evaluate the quality of F. thunbergii; peiminine， peimine and cyclobalamine and so on may be the quality markers of anti-inflammatory effect of F. thunbergii.

KEYWORDS Fritillaria thunbergii; Anti-inflammatory effect; UPLC-Q-TOF-MS/MS; Bivariate correlation analysis; Grey correlation analysis; Quality markers

浙贝母是百合科植物浙贝母（Fritillaria thunbergii Miq.）的干燥鳞茎，具有清热、化痰、止咳、解毒、散结、消痈等功效，主治风热犯肺、痰火咳嗽、肺痈、乳痈、瘰疬和疮毒等症[1]。近年来研究表明，浙贝母的化痰、止咳、松弛气管平滑肌、抗炎等作用是其治疗呼吸系统疾病的药理学基础[2]，其中浙贝母化痰、止咳的活性成分已较为明确，但对其抗炎活性成分的研究相对较少，主要集中在生物碱类成分贝母素甲和贝母素乙[3-5]。

质量标志物是2016年提出的中药质量评价新概念，即通过一系列筛选和验证研究，确定与该药物目标活性相关的成分，作为反映其安全性和有效性的标志性物质进行质量控制[6-7]。中药谱-效研究是筛选中药质量标志物的重要方法和技术之一，即先将化学指纹图谱中有用的化学信息提取出来，然后与药效实验结果相结合，通过线性或非线性数学处理，建立谱-效数学模型，从而确定与药效相关的化合物[8]。本研究采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱法（UPLC-Q-TOF-MS/MS）建立10批不同产地浙贝母的指纹图谱;以小鼠耳肿胀度和血清中丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）水平为药效指标，采用双变量相关分析法和灰色关联度分析法对UPLC-Q-TOF-MS/MS指纹图谱中各共有峰与抗炎药效指标的相关性进行分析，从而筛选出质量标志物并进行鉴定，以期初步揭示浙贝母具有抗炎作用的药效物质基础，为其质量控制和资源开发提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Acquity型UPLC色谱仪、PGA495型MS仪（美国Waters公司）;125D-1CN型十万分之一电子分析天平（德国Sartorius公司）;VS10-300C型超声波清洗器（无锡沃信仪器制造有限公司）;HH-W420型电热恒温水浴锅（济南欧莱博科学仪器有限公司）;UV-5200PC型紫外可见分光光度计（上海力申科学仪器有限公司）;HBS-1096A型酶标仪（南京德铁实验设备有限公司）;FrontierTM 5000型微量高速離心机（美国Ohaus公司）。

1.2 药品与试剂

西贝素、贝母辛、贝母素甲、贝母素乙对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号：B21331、B20082、B20080、B20081，纯度均大于99.0%）; MDA、NO酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20190203、20190119）;地塞米松片（遂成药业股份有限公司，批号：180803，规格：0.75 mg）;甲醇、乙腈为色谱纯，甲酸为质谱级，水为纯净水。浙贝母药材购于浙江磐安药材市场，经浙江医药高等专科学校中药学院杨雄志教授鉴定为百合科植物浙贝母（F. thunbergii Miq.）的干燥鳞茎，药材信息详见表1。

1.3 动物

洁净级ICR小鼠，雌雄各半，体质量（20±2） g，购于长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，动物生产许可证号：SCXK（吉）2018-0007。

2 方法与结果

2.1 色谱与质谱条件

色谱条件：色谱柱为Agilent Zorbax HPLC Eclipse Plus C18（150 mm×3 mm，1.8 μm）;流动相为乙腈（A）- 0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～5 min，2%A→25%A;5～10 min，25%A→45%A;10～15 min，45%A→80%A;15～25 min，80%A→100%A;25～30 min，100%A;30～33 min，100%A→2%A）;流速为0.4 mL/min;柱温为30 ℃;进样量为2 ?L。

质谱条件：电喷雾离子源，V模式，电压为3.0 kV，离子源温度为100 ℃，去溶剂气温度为400 ℃;正、负离子扫描模式，扫描范围为质荷比（m/z）50～1 200;去溶剂气流速为800 L/h。

2.2 供试品溶液的制备

取浙贝母药材适量，粉碎，过四号筛（下同），取其粉末2 g，加入浓氨水溶液4 mL，浸润1 h，加入三氯甲烷-甲醇（4 ∶ 1，V/V）40 mL，混匀，称定质量，于80 ℃水浴加热回流2 h，放冷，补足减失的质量，过滤;取续滤液10 mL，于98～100 ℃水浴条件下蒸干，残渣以甲醇溶解并定容于2 mL 量瓶中，即得供试品溶液。

2.3 方法学考察

本研究在正、负离子扫描模式下均进行方法学考察。

2.3.1 精密度试验取浙贝母药材（编号：S1）粉末2 g，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱与质谱条件连续进样5次。在正、负离子扫描模式下，分别以6号峰（贝母素甲）、5号峰（浙贝素）的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，在正离子扫描模式下，26个共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于2.40%（n=5）;在负离子扫描模式下，10个共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于2.80%（n=5），详见表2、表3。这表明本方法精密度良好。

2.3.2 重复性试验取浙贝母药材（编号：S1）粉末2 g，共5份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱与质谱条件进样分析。在正、负离子扫描模式下，分别以6号峰（贝母素甲）、5号峰（浙贝素）的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，在正离子扫描模式下，26个共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3.00%（n=5）;在负离子扫描模式下，10个共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于2.70%（n=5），详见表2、表3。这表明本方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验取浙贝母药材（编号：S1）粉末2 g，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别于室温下放置0、2、4、6、12、24 h后，按“2.1”项下色谱与质谱条件进样分析。在正、负离子扫描模式下，分别以6号峰（贝母素甲）、5号峰（浙贝素）的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，在正离子扫描模式下，26个共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于2.90%（n=5）;在负离子扫描模式下，10个共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3.00%（n=5），详见表2、表3。这表明供试品溶液于室温下放置24 h内稳定性良好。

2.4 浙贝母UPLC-Q-TOF-MS/MS指纹图谱的生成及相似度分析

2.4.1 指纹图谱的生成取10批浙贝母药材样品粉末，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱与质谱条件进样分析，分别在正、负离子扫描模式下采集图谱，然后将图谱文件导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004A版），以中位数法生成UPLC-Q- TOF-MS/MS指纹图谱。结果，在正、负离子模式下，10批浙贝母药材分别各有共有峰26、10个，详见图1。

2.4.2 相似度分析采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004A版）进行相似度评价，按照相关步骤进行色谱峰的匹配及对照图谱（R）的生成。以对照图谱为参照图谱，将10批浙贝母指纹图谱分别与其进行比较，并计算相似度值。结果，在正、负离子模式下，10批浙贝母药材的相似度均分别大于0.840、0.810，表明不同产地浙贝母药材中所含化学成分有一定的差异，详见表4。

2.5 浙贝母的抗炎作用考察

2.5.1 分组、造模与给药将小鼠分为模型组（生理盐水）、阳性对照组（地塞米松，0.000 4 g/kg，根据人与小鼠等效剂量系数换算）和10批浙贝母高、低剂量组（1.3、0.325 g/kg，均以生药量计，根据人与小鼠等效剂量系数换算，其中高剂量为临床等效剂量的2倍），共22组，每组10只，每天灌胃给药1次（临用时均用水制成相应药液），连续给药7 d。末次灌胃给药30 min后，取20 ?L二甲苯涂布于各组小鼠右耳的前后两面以复制炎症模型，并以其左耳作为空白对照，涂布生理盐水。

2.5.2 小鼠血清中MDA、NO水平检测造模1 h后，各组小鼠摘眼球取血，以3 500 r/min离心后取上层血清，根据相应试剂盒说明书操作，检测血清中MDA、NO的水平。结果，与模型组比较，阳性对照组和10批浙贝母高、低剂量组小鼠血清中MDA水平均显著升高，NO水平均显著降低（P<0.05或P<0.01），詳见表5。

2.5.3 小鼠耳肿胀度的检测参考相关文献方法[9]，将各组小鼠脱颈处死，用直径为9 mm的打孔器在小鼠左、右耳对称部位打下圆耳片，称定质量，并计算耳肿胀度（耳肿胀度=右圆耳片质量-左圆耳片质量）。结果，与模型组比较，阳性对照组和10批浙贝母高、低剂量组小鼠耳肿胀度均显著减少（P<0.05或P<0.01），详见表5。

2.6 浙贝母谱-效相关性分析

2.6.1 双变量相关分析参考相关文献方法[10]，以均值化后的10批浙贝母指纹图谱的共有峰相对峰面积为因变量，抗炎指标小鼠耳肿胀度和血清MDA、NO水平为自变量，采用SPSS 19.0软件进行双变量相关分析，计算各变量与共有峰相对峰面积的相关系数。当相关系数绝对值大于0.6时，表示显著相关;当该值大于0.7时，表示极显著相关。结果，在正离子模式下，12、21号峰相对峰面积与耳肿胀度显著相关，5、6、7、9、11、17号峰相对峰面积与NO水平显著相关，12、14号峰相对峰面积与NO水平极显著相关;负离子模式下没有色谱峰与抗炎指标呈显著相关，详见表6、表7。

2.6.2 灰色关联度分析以10批浙贝母指纹图谱共有峰的相对峰面积为子序列，以小鼠耳肿胀度和血清中MDA、NO水平为母序列，进行灰色关联度分析。当关联度>0.5时，认为子序列与母序列之间有着一定的关联性，且关联度数值越高，说明关联性越强[11]。结果，在正离子模式下，1、3、4、5、6、7、9、10、11、12、14、17、20、21、24、26号峰与耳肿胀度和MDA、NO水平均相关;在负离子模式下，3、5号峰与耳肿胀度和MDA、NO水平均相关，详见表8、表9。

综合双变量相关分析和灰关联度分析结果可知，与抗炎指标相关的共有峰分别为5、6、7、9、11、12、14、17、21号峰，初步推测这9个峰所对应的化合物为浙贝母抗炎作用的质量标志物。

2.7 浙贝母抗炎质量标志物的化学成分鉴定

通过查阅相关文献[12-18]，构建浙贝母化学成分的数据集，包括化学成分、英文名称、分子式、结构以及化学物质登录号等。利用Waters Masslynx 4.1软件，对“2.6”项下筛选出的与抗炎作用相关的9个共有峰进行成分结构表征。方法参数设置如下：保留时间范围为0～33 min，保留时间误差限为0.01 min，质量误差限为0.01 Da，质量精确度小于10 ppm。将各共有峰的峰强度、保留时间和m/z等信息与对照品进行比较，同时结合化合物的一、二级质谱信息和裂解规律，参考文献资料进行分析，结果详见表10。

由表10可知，浙贝母质量标志物为贝母素乙、贝母素甲、环巴胺、胡萝卜苷、Polyphyllin Ⅴ、苦鬼臼毒素、植物甾醇、Ent-kaur-15-en-17-ol、Ent-17-norkauran-16-one。

3 讨论

UPLC-Q-TOF-MS/MS法将液相色谱的高分离效能与质谱的强大结构鉴定功能相结合，故在中药化学成分分析、中药质量控制等研究中得到广泛应用。本研究采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术建立了10批不同产地浙贝母药材的指纹图谱。在试验前期，笔者考察了色谱分析的条件后发现，利用乙腈-0.1%甲酸水溶液梯度洗脱的分离效果优于甲醇-水溶液，且色谱图中各峰峰形稳定、分离度良好。

地塞米松是一种人工合成的皮质类固醇，属于肾上腺皮质激素类药，可抑制炎症部位中白细胞和巨噬细胞的聚集，减弱两者的吞噬作用，并对溶酶体酶以及炎症介质的合成和释放起到抑制作用，能够减轻和防止炎症反应，从而达到减轻炎症的效果[19]，故在浙贝母抗炎作用实验中将其作为阳性对照。

本研究选用二甲苯对小鼠耳廓进行造模，可迅速引起小鼠耳血管内液向组织液渗出，导致耳肿胀，产生炎症[20]。炎症状态下，MDA 是氧自由基与细胞膜上不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应的产物，可间接反映血浆中氧自由基的水平，且其水平与抗炎效果呈正相关;NO 由内源性一氧化氮合酶（NOS）催化 L-精氨酸生成，NOS主要分布于巨噬细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞中，在炎症状态下大量产生，继而催化产生大量 NO，加重炎症反应[21]。本研究结果显示，不同产地浙贝母药材均具有良好的抗炎作用。

双变量相关分析是研究2个或2个以上随机变量间相关关系的统计分析方法[22]，本研究将中药指纹图谱中各色谱峰看作为一个变量，各抗炎指标也可看作一个变量，分析两者之间的相关程度。灰色关联度分析适用于系统信息量较少而涉及因素多的图谱，有利于体现各成分间的相互作用，同时关联系数可反映2个被比较序列的紧密程度[23-24]。本研究综合双变量相关分析和灰关联度分析的结果，推测出与抗炎作用相关的共有峰有9个，经鉴定分析确定为贝母素乙（5号峰）、贝母素甲（6号峰）、环巴胺（7号峰）、胡萝卜苷（9号峰）、Polyphyllin Ⅴ（11号峰）、苦鬼臼毒素（12号峰）、植物甾醇（14号峰）、Ent-kaur-15-en-17-ol（17号峰）、Ent-17-norkauran-16-one（21号峰）。

综上所述，本研究建立了不同产地浙贝母的UPLC-Q-TOF-MS/MS指纹图谱，并初步推测贝母素乙、贝母素甲、环巴胺、胡萝卜苷、Polyphyllin Ⅴ、苦鬼臼毒素、植物甾醇、Ent-kaur-15-en-17-ol、Ent-17-norkauran- 16-one是其具有抗炎作用的质量标志物，这可为后续浙贝母的质量控制及资源开发提供参考。

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