朱松梅，董玉瑛，沙志新，方政，邹学军

大连民族大学环境与资源学院，大连 116605

环境中很多新型有机污染物(emerging organic contaminants, EOCs)来源于医药品和个人护理品，EOCs在环境中的“假持久性”和对生态系统产生的不利影响逐渐被发现并引起重视[1-2]。城市中排放的大部分EOCs来自于医院、住宅区和制造厂等不同的人类活动，这些污染物最终随管网进入污水处理厂[3-4]。目前，污水处理厂用化学需氧量、总有机碳、总氮和总磷等传统的综合指标监控出水水质，这些反映污染物整体水平的指标不能针对说明个别污染物是否达到排放标准，其排入地表水中，可能会产生药物残留物及代谢产物，随生物链传递，使生物被动吸收污染物并在体内不断积累，长时间作用可能会产生一定的生物蓄积和耐药性[5]。探究靶向明确的敏感指标有利于提出合理的应对措施。

调控污泥生化过程的稳定是利用活性污泥法处理污水的关键，其中，不同功能酶在各类污染物胁迫下的应激效应可直接反映活性污泥的生化性能，这与污泥系统去除污染物的能力具有相关性[6]。脲酶是一种含镍的水解酶，与氮循环和微生物的代谢有着密切的联系，能专一催化尿素水解为CO2和NH3，反应速率是无催化反应速率的1015倍[7]。分析EOCs对污泥脲酶活性的影响，可为提高或调控污水脱氮工艺的速率提供参考。发光菌具有快速、灵敏、操作简单和应用范围广泛等优点，已有研究将发光菌用于评价排污口污水中总有机污染物毒性[8]。本研究旨在观察几种不同浓度大环内酯类抗生素对好氧活性污泥中脲酶活性的影响，并对比相同污染物胁迫下海洋明亮发光菌的响应，通过分析EOCs对脲酶和发光菌影响的动力学曲线，为控制EOCs对污泥活性产生不利影响的潜在风险提供基础数据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 主要实验仪器

THZ-82气浴恒温震荡器(江苏金坛市金城国胜试验仪器厂)；DHP-9082电热恒温培养箱(上海一恒科技有限公司)；85-2型恒温磁力搅拌器(上海司乐仪器厂)；SW-CJ-1BU净化工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；BS214D型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。

1.2 主要试剂

红霉素肠溶片购于西安利君制药有限责任公司；罗红霉素分散片购于哈药集团制药六厂；乙酰螺旋霉素片购于西南药业股份有限公司；阿奇霉素分散片购于东北制药集团沈阳第一制药有限公司。大环内酯类抗生素的成药除有效成分外，还包含羟丙基纤维素与羧甲基淀粉钠崩解剂、乳糖与微晶纤维素润滑剂等辅料(也称赋形剂)，赋形剂与主药无配伍禁忌，不产生副作用，不影响疗效，在常温下不易变形、干裂、霉变、虫蛀、对人体无害和无生理作用，不与主药产生化学或物理作用。在获得纯品有难度的情况下，本研究采用经校正成药的有效成分进行暴露实验[9]。海洋明亮发光杆菌冻干粉购自中国科学院南京土壤研究所微生物室。活性污泥取自大连某污水处理厂。

1.3 海洋明亮发光菌的培养和毒性分析

经发光菌冻干粉剂复苏、斜面菌种培养、摇瓶菌液培养和工作菌液制备后，进入毒性暴露实验[10]。调配工作菌液的发光强度在300～900 mV。将待测化合物用质量分数为3%的 NaCl溶液稀释配制为十几个对数等间距分布的浓度，吸取不同梯度的样品溶液2 mL于具塞磨口比色管中，以2 mL质量分数为3%的NaCl溶液作空白对照，再将0.5 mL的工作菌液加入测试管中，加塞上下振荡均匀，去塞，精确计时，于暴露15 min时测定发光强度。每组浓度梯度做3～5个平行样，确保毒性分析结果标准偏差低于10%。

1.4 脲酶活性的测定

脲酶活性采用苯酚钠比色法测定[11]，以1 g烘干污泥24 h生成NH3-N的毫克数表示。脲酶活性测定的抗生素浓度0、15、30、90、120、150、180和240 μg·L-1，以1∶1的药泥体积比进行暴露，将污泥在抗生素下的暴露时间设置为15 h。在暴露后的污泥中取5 mL污泥悬浊液和上清液分别与1 mL甲苯混合于50 mL容量瓶中，此处加入少量甲苯能够使微生物溶解释放出脲酶并且能够使后续尿素水解速率大幅增加[12-13]。200 r·min-1下震荡20 min后，加入1 mL 10%尿素溶液和4 mL柠檬酸缓冲溶液(pH=6.7)，于37 ℃恒温培养箱中培养24 h。取出后充分摇匀，用9 cm滤纸将混合液过滤至干净的试管。取出3 mL滤液转移至50 mL容量瓶中，依次加入4 mL 0.28 mol·L-1苯酚钠和3 mL 1%次氯酸钠。将混合液混匀静置20 min后呈靛蓝色。最后稀释至50 mL刻线处并在578 nm下测其吸光度。

脲酶活性=(a样品-a无污泥-a无基质)×V×n/m

式中：a样品、a无污泥和a无基质分别为样品、无污泥和无基质对应吸光度值按标准曲线求得的NH3-N毫克数；V为显色液体积(mL)；n为分取倍数，浸出液体积/吸取滤液体积；m为烘干污泥的质量(g)。

1.5 实验质量控制

通过多次测量空白组脲酶活性，对其进行误差校正，最终确定为141.5 mg(NH3-N)·g-1。曝气池中污泥混合液悬浮固体(MLSS)质量浓度为3 049 mg·L-1，挥发性悬浮物(VSS)约为0.7 mg·L-1，污泥容积指数(SVI)在80～120 mL·g-1。

2 结果与讨论 (Results and discussion)

2.1 大环内酯类抗生素对海洋明亮发光菌的毒性作用

4种抗生素对发光菌呈现不同程度的抑制作用(图1)，阿奇霉素、红霉素、罗红霉素和乙酰螺旋霉素的半最大效应浓度(EC50)分别为30.05×10-5、71.70×10-5、108.6×10-5和63.44×10-5mol·L-1，抗生素浓度和发光菌死亡率之间的可决系数(R2)经显著性水平检验，置信区间范围>90%(表1)。根据抗生素对发光强度的影响及EC50可知，4种抗生素的单一毒性大小为：阿奇霉素>乙酰螺旋霉素>红霉素>罗红霉素。

图1 大环内酯类抗生素对海洋明亮发光菌的毒性作用Fig. 1 Toxicity of macrolide antibiotics to Photobacterium phosphoreum

表1 4种大环内酯类抗生素对发光菌单独作用时的半最大效应浓度(EC50)Table 1 Concentration for 50% of maximal effect (EC50) values for Photobacterium phosphoreum when four macrolide antibiotics act alone

2.2 大环内酯类抗生素对脲酶的毒性作用

脲酶在4种大环内酯类抗生素的胁迫下表现出不同的应激反应，根据脲酶活性的变化得到4种抗生素的毒性作用强弱为：阿奇霉素>乙酰螺旋霉素>红霉素>罗红霉素(图2)。其中，红霉素、乙酰螺旋霉素和罗红霉素胁迫下脲酶活性表现为先激活后抑制，这种现象被称为毒物兴奋效应，即在相同测量参数下，高剂量和低剂量观察到相反的效应[14]；阿奇霉素的毒性在4种抗生素中最大，对脲酶呈现抑制效果。

图2 大环内酯类抗生素作用下脲酶的变化注：虚线为每种抗生素对脲酶影响的拟合趋势线。Fig. 2 Changes of urease under the action of macrolide antibioticsNote: The dotted line is the fitted trend line of the influence of each antibiotic on urease.

阿奇霉素与罗红霉素均属于第二代大环内酯类抗生素，二者在抗菌作用和抗菌谱间存在差异。阿奇霉素为15元氮杂大环内酯类，具有抗菌谱广、抗菌活性强、血液和组织浓度高以及半衰期长等特点，其抗菌作用更强劲，但不良反应也更多、更严重；罗红霉素为14元大环内酯类，抗菌谱和抗菌作用基本上和红霉素相仿，仅有少部分作用对象会出现较轻的不良反应[15-16]。这与本文关于二者对发光菌和脲酶单一毒性作用的研究结果均一致。

2.3 脲酶和发光菌的毒性作用分析和环境影响评价

污染物对脲酶和发光菌的毒性作用结果一致，但随污染物浓度增加发光菌的发光强度减弱，脲酶则呈现非单调趋势。用发光菌的发光强度判断污染物毒性，结果表明，污染物浓度与发光强度呈显著负相关关系，这与方战强等[17]的研究结果相似，污染物与发光菌之间为单向影响。对于脲酶而言，不仅污染物的含量会对其活性产生影响，且脲酶和氮循环密切相关，需要与其他微生物一起参与物质转化和生化反应，故污染物与脲酶之间存在双向影响[18]。活性污泥成分复杂，其中，脲酶来自不同的微生物群落，各个群落间存在一定协同和拮抗作用，不同群落之间相互影响，即它们在不同梯度暴露水平下对营养的竞争更能体现生长抑制或是协同作用[19]。这些原因导致抗生素对脲酶的毒性作用呈现波动变化。而单一的模式生物发光菌的毒性实验中没有复杂的生长环境，毒性作用多为单调变化趋势。如图2所示，添加了每种抗生素对脲酶影响的趋势线，每种抗生素都是在某个浓度范围出现个别异于趋势线的波动点，根据变化率可以发现其波动范围都比较小，包括在波动点范围内的趋势仍为促进作用。脲酶和发光菌都能对环境，尤其水生生态系统起到较好的指示作用。

2.4 脲酶影响脱氮过程的作用机理

近年来，二、三季度藻类水华现象频发，氨氮含量增加是直接因素[20]。为降低水体富营养化风险和受纳水体的负荷，对于氮磷的去除要求不断提升。对比污水厂污泥驯化时微生物的存在和变化规律，随着污泥驯化的进行，出现了2种代表污泥系统稳定运行的微生物——钟型虫和轮虫，且脲酶活性不断增加说明酶活性和生物相间有显著正相关关系[21]。通过改变微生物的结构和种群密度能影响活性污泥分泌脲酶。污水厂生物脱氮工艺包括好氧段和缺氧段。好氧脱氮方式主要为氧化酶催化下的氧化脱氨反应和某些好氧菌在水解酶催化作用下的水解脱氮反应(式(1))，若没有催化作用的水解反应则要消耗更多水(式(2))。在好氧条件下，硝化反应先将氨氮氧化为硝酸盐(式(3))，再在缺氧条件下通过反硝化反应将硝酸盐还原成气态氮(式(4))排出完成脱氮[22]。

氨化反应方程式：

↓没有催化作用的消去反应

(2)

硝化总反应方程式：

(3)

反硝化总反应方程式：

(4)

脲酶属于专一水解尿素的含镍水解酶，当污染物对脲酶活动进行干扰时，可能是由抗生素某些类似尿素的惰性结构替代了底物，进入脲酶活性中心与Ni2+发生作用，抑制了脲酶水解尿素[23]。这在一定程度上可能对氨化过程产生抑制，影响硝化和反硝化反应的效率，对脱氮工艺产生负面影响。

2.5 污水处理系统污泥稳定性和耐药性的传播风险

脲酶很有可能在低浓度的乙酰螺旋霉素、红霉素和罗红霉素的胁迫下产生了一定的耐药性。这种情况的发生使抗生素和抗生素耐药性决定因素通过污水处理厂排入到水生环境中，可能影响其他生物对污染物的响应，长此以往容易削弱这些药物治疗感染性疾病的能力[24]。水生生态系统的复杂性以及污染物传播途径的多样性使污染物在环境中的不可控性可能比实验的预估风险更高[4]。

抗生素耐药性环境传播的潜在途径如图3所示。环境中存在的大量抗生素会对周围菌种产生刺激，从而引起环境中的菌株通过低于致死剂量的抗生素诱导基因产生新突变以及通过基因水平转移而获得耐药性。基因转移对抗生素抗性基因环境传递有很大影响，携带耐药基因的DNA可以在相同或不同种属的细菌间相互传播，并在不同环境介质中扩散[25-27]。考虑到有些污水厂的出水可能用于二次灌溉，基于脲酶与环境间的双向作用，若出水中脲酶过多流向土壤，容易使尿素水解过快导致氨挥发使土壤氮素损失[7]。因此，污水厂出水中对脲酶的监测同样重要，这有助于污水处理工艺控制出水水质。

图3 抗生素耐药性环境传播潜在途径Fig. 3 Potential path of antibiotic resistance environment transmission

污染物通过污水厂的出水进行污染传播，以脲酶和海洋明亮发光菌反映了其在生物体和环境中的发生、传播与存在。污水处理过程中污染物对脲酶与其底物的作用进行阻断，而污染物对发光菌的影响多是通过对其发光强度的响应进行评价。研究中4种抗生素对脲酶和发光菌的单一毒性作用基本一致，二者的不同之处主要在于：污染物对发光菌的影响是单向的，而脲酶与污染物之间存在双向影响。研究可在一定程度上用于EOCs的环境风险评价和适当干预措施的设计，以确保水环境的良好状态。