王绿平，张京佶，殷浩文

上海市检测中心生物与安全实验室，上海 201203

生态毒理学中，鱼类作为水生生态环境体系中的顶级脊椎动物，在化学品毒性研究及环境风险评估中，具有重要的作用和意义。然而，随着替代(Replacement)、减少(Reduction)、优化(Refinement)(3Rs)原则[1]在哺乳动物毒性测试中得到广泛认可，近年来，该理念在环境毒理学领域也逐渐被关注[2]。欧盟分别于2009年和2013年，禁止用化妆品原料进行脊椎动物试验以及禁止销售用动物试验检测的化妆品原料及成品。此外，欧洲《化学品的注册、评估、授权和限制》(REACH)法规也高度关注化学品毒性测试中实验动物福利问题，提倡减少测试中脊椎动物的数量，推动非动物测试(如胚胎、细胞和组织等)和替代策略的开发和验证。

采用鱼类胚胎测定化学品的毒性除了可满足现行动物福利法规的要求，同时具有材料方便易得、操作简单、可重复性及可靠性较高等优点，而且与传统的鱼类急性实验相比，成本低，影响因素少，灵敏度更高，现已被广泛应用于化合物的致毒和致畸效应研究。

稀有鮈鲫(Gobiocyprisrarus)是我国特有的一种小型鲤科鱼类[3]，也是我国化学品环境管理中首选试验鱼种。其亲鱼性成熟时间短，繁殖季节长，产卵量大，可常年人工繁殖，因此，具有成为中国特有模式鱼种的潜能。由于其胚胎也具有光学透明性，可透过卵膜清晰观察胚胎发育，同时其胚胎的形态特征、发育过程及孵化时间也与多数淡水硬骨鱼类似[4]，因此，以稀有鮈鲫为实验材料，开展相关的胚胎毒理学研究有一定的基础依据。此外，稀有鮈鲫生物学特征研究已较为系统，研究工作涉及鱼病学、遗传学、环境科学、胚胎学和生理学等领域[5-9]。在此基础上，开展稀有鮈鲫在胚胎领域的毒理学研究将推动我国特有标准试验鱼种用于生态毒性测试的可持续战略，拓展稀有鮈鲫在毒性测试中的使用范围，为其最终成为国际公认的标准试验物种创造条件。

采用鱼类胚胎进行相关毒性测试试验，如《OECD化学品测试准则No.236鱼类胚胎急性毒性试验》[10]、《OECD化学品测试准则No.210鱼类早期生活阶段毒性试验》[11]、《OECD化学品测试准则No.212鱼类胚胎-卵黄囊吸收阶段的短期毒性试验》[12]等，均要求在鱼卵受精后尽可能快地开始试验，胚胎应尽量在囊胚分裂前暴露于试验溶液中，最晚不能晚于16细胞期(距受精时间115 min)。而养殖的稀有鮈鲫，产卵活动一般发生在傍晚至午夜(18:00—24:00)之间，产卵持续2～4 h。夏季产卵时间较晚，而初春、秋末及冬季产卵时间较早。在阴雨天也偶见中午、下午产卵[8]。

本研究以稀有鮈鲫胚胎为试验材料，研究稀有鮈鲫胚胎在实验室条件下和室内模拟环境条件下的自然孵化率和受精率，获得产生足量、高质量和适用于试验的稀有鮈鲫胚胎的孵化条件，为鱼类胚胎急性毒性试验、鱼类早期生活阶段毒性试验、鱼类胚胎-卵黄囊吸收阶段的短期毒性试验等胚胎相关毒性试验研究提供足量和高质量的胚胎。同时，为稀有鮈鲫成为国际认可的中国标准试验鱼种奠定基础，为国内相关检测标准的建立提供技术支撑。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 试验动物

本研究中所使用的稀有鮈鲫源自中国科学院水生生物研究所构建的稀有鮈鲫IHB系(野生封闭群)或引种后自行繁育。实验室驯养条件下的稀有鮈鲫无肉眼可观察的感染或疾病，且未经任何药物处理。试验所使用的亲鱼已繁殖至少2次以上，以保证有良好的受精率。单次试验所用胚胎均为同一批次，细胞期均为16细胞期以内。

1.2 仪器设备及器皿

体视显微镜(Lumar V12，卡尔蔡司，德国)；人工气候箱(QHX-400BS-III，上海新苗医疗器械制造有限公司)；多参数水质分析仪(WTW Multi 3430，赛默飞世尔，美国)；吸管(3 mL)；培养皿(Φ=60 mm)。

1.3 试验用水

试验用水为经活性炭过滤、紫外灭菌的自来水，并在恒温储水箱中连续曝气至氧饱和，恒温(26±1) ℃。水硬度为100～300 mgL-1(以CaCO3计)，pH为6.5～8.5，试验期间变化不超过1.5个单位。

1.4 试验方法

1.4.1 稀有鮈鲫胚胎的自然受精率和孵化率

试验设为正常光照组和光照周期颠倒组。正常光照组光照为自然光照(光照12～16 h)，水温维持在21～25 ℃范围内。光照周期颠倒组昼夜由定时器控制，提供12 h(光)∶12 h(暗)的循环光照，早上7:00至下午7:00为黑暗，下午7:00至第2天早上7:00为光照，水温维持在21～25 ℃范围内。正常光照组和光照周期颠倒组稀有鮈鲫亲鱼均按雌雄分别驯养在不同的玻璃水族箱中，雌雄亲鱼各2个水族箱，每日均投喂冷冻高维大赤虫2次(早晚各1次)。所有亲鱼均已性成熟，繁殖次数超过3次，且胚胎的受精率达90%以上。

试验用鱼卵以分组产卵方式获得，按雌雄比例1∶2将6尾性成熟的稀有鮈鲫亲鱼，即分别从雌性亲鱼驯养水族箱和雄性亲鱼驯养水族箱中取出2尾和4尾亲鱼，光照周期颠倒组于试验当天早晨7:00置于交配盒中，正常光照组于试验前一天16:00置于亲鱼繁殖用交配盒中，为防止亲鱼捕食鱼卵，在交配盒中放入网架(孔径大小约为(2±0.5) mm)。正常光照组于试验当天早上取出亲鱼，收集鱼卵；光照周期颠倒组待灯光转暗后2～3 h，取出亲鱼，收集鱼卵。产卵结束后，将亲鱼雌雄分开放回原驯养水族箱中。

收集获得的稀有鮈鲫胚胎，将所有胚胎用吸管移至培养皿中，在温度维持在24～26 ℃范围内的显微镜房于放大倍数为40倍的体视显微镜下进行镜检并计算胚胎总数(n)。后将胚胎放置于温度维持在25～27 ℃之间，光照周期为12 h(光)∶12 h(暗)的人工气候箱中进行实验，实验周期为96 h。24 h后，于体视显微镜下镜检并计算未受精(卵黄凝结，图1)的胚胎数(x)，计算稀有鮈鲫在正常光照条件下和光照周期颠倒条件下的自然受精率((n-x)/n×100%)；96 h后，观察和计算胚胎的孵化数(h)，并计算孵化率(h/(n-x)×100%)。

本试验重复进行9次，试验频率为7 d，每次试验均从相同的亲鱼驯养水族箱中取出雌雄亲鱼进行试验。

1.4.2 稀有鮈鲫胚胎发育时序及特征

收集正常光照组和光照周期颠倒组自然受精的稀有鮈鲫胚胎，选择受精时间不超过30 min的鱼卵，用吸管移至培养皿中。参考文献[13](表1)，在放大倍数为40倍的体视显微镜下定期观察并拍摄鱼类胚胎发育的全过程，即从受精后分裂2细胞期至仔鱼孵出，试验持续96 h。试验期间，胚胎培养温度维持在25～27 ℃之间，光照周期为12 h(光)∶12 h(暗)，并在整个观察过程中保持环境条件的稳定。显微镜房间温度维持在24～26 ℃之间，每次观察时间为30～60 min。

图1 未受精胚胎(卵黄凝结)Fig. 1 Unfertilized embryo of Gobiocypris rarus (yolk condensation)

2 结果与讨论(Results and discussion)

2.1 稀有鮈鲫胚胎的自然受精率和孵化率

正常光照和光照周期颠倒条件下，稀有鮈鲫胚胎的96 h自然受精率和孵化率试验结果如表2和表3所示。结果表明，正常光照条件下，9次重复试验中4次未产生胚胎，其余5次均产生胚胎。5次产生胚胎中2次的胚胎自然受精率和孵化率均为0，其余3次胚胎的自然受精率在80.0%～87.4%之间，平均值为83.8%，变异系数(CV)为4.42%；孵化率在61.7%～76.8%之间，平均值为69.0%，CV为11.0%。光照周期颠倒条件下，9次重复试验的自然受精率在80.3%～98.5%之间，平均值为92.2%，变异系数(CV)为5.65%；96 h自然孵化率在80.0%～100%之间，平均值为92.8%，CV为6.21%。由结果可知，在光照周期颠倒和(26±1) ℃条件下，稀有鮈鲫胚胎自然受精率和96 h孵化率的平均值均可达到90%以上，完全可满足鱼类胚胎急性毒性试验中对试验用胚胎总受精率≥70%、96 h空白对照组孵化率≥80%的要求。此外，9次试验的受精率与孵化率CV均<10%，表明试验结果稳定，重复性好。光照周期颠倒条件下，稀有鮈鲫胚胎的自然受精率和孵化率比正常光照条件下稀有鮈鲫胚胎的自然受精率和孵化率高，这可能是因为正常光照条件下驯养的稀有鮈鲫亲鱼受外界环境干扰大，且环境相对不够安静，光照时间不稳定等，有待后续进一步研究证实。

表1 稀有鮈鲫发育时序及主要形态特征[13]Table 1 Developmental timing and morphological fearures of Gobiocypris rarus[13]

表2 正常光照条件下稀有鮈鲫胚胎的自然受精率和孵化率((26±1) ℃)Table 2 Natural fertility and hatchability of Gobiocypris rarus embryo under normal illumination conditions ((26±1) ℃)

表3 光照周期颠倒条件下稀有鮈鲫胚胎的自然受精率和孵化率((26±1) ℃)Table 3 Natural fertility and hatchability of Gobiocypris rarus embryo under illumination cycle reversal conditions ((26±1) ℃)

2.2 稀有鮈鲫胚胎发育时序及特征

2.2.1 表观特征

肉眼观察稀有鮈鲫胚胎呈圆形(图2)，遇水后略微膨胀，饱满且具有弹性。卵壳膜无色透明，易于看清胚体发育进展和活动状况。卵膜有粘性，可粘沉于容器底部，不易随水流波动。随着孵化的进行，卵膜的粘性逐渐减弱。卵膜的粘性可使胚胎得以固定，便于在体视显微镜下观察。最新的研究表明，稀有鮈鲫卵膜的粘性也可以通过次氯酸钠浸泡进行消除，进而方便胚胎转移。稀有鮈鲫的胚胎外观无极性，卵膜径均>1 mm，卵膜径的大小与水体的硬度(或离子浓度)有很大的关系[15]。

2.2.2 胚胎发育时序及特征

在放大倍数为40倍的体视显微镜下观察正常光照组和光照周期颠倒组的稀有鮈鲫胚胎发育过程。结果显示，2种条件下获得的受精卵的发育时序和特征相同，均包含卵裂期、囊胚期、原肠期、分裂期、成形期和孵化期等发育时期。图3为光照周期颠倒条件下稀有鮈鲫胚胎的各发育时期。稀有鮈鲫胚体体表的色素显著少于斑马鱼，在体视显微镜下可清楚观察胚胎内发育状况和胚胎的形态异常特征。

图2 稀有鮈鲫胚胎的表观特征Fig. 2 Appearance features of Gobiocypris rarus embryo

图3 光照周期颠倒条件下稀有鮈鲫胚胎发育时序及特征((26±1) ℃)注：(a). 2细胞期；(b). 4细胞期；(c). 多细胞期；(d). 囊胚早期；(e). 囊胚中期；(f). 囊胚晚期；(g). 原肠早期；(h). 原肠中期；(i). 原肠晚期；(j). 胚孔封闭；(k). 眼基；(l). 眼囊；(m). 尾鳍；(n). 肌肉效应；(o). 心脏搏动；(p). 眼灰；(q). 眼黑；(r). 孵出。Fig. 3 Developmental timing and characteristics of Gobiocypris rarus embryo under illumination cycle reversal condition ((26±1) ℃)Note: (a).two-cell stage; (b). four-cell stage; (c). multicellular stage; (d). early blastula; (e). mid-blastula; (f). late blastula; (g). early gastrula; (h). mid-gastrula; (i). late gastrula; (j). closure of blastopore; (k). optic rudiment; (l). optic vesicle; (m). caudal fin; (n). muscular contraction; (o). heart pulsation; (p). greyish eyes; (q). melanoid eyes; (r). hatching.

观察发现，稀有鮈鲫的胚胎发育过程与多数淡水硬骨鱼类相似。卵受精后30 min即在动物极形成胚盘，10 min后以纵裂的方式开始进行胚胎分裂，逐步分裂成2细胞、4细胞等(图3(a)和(b))，胚层逐渐隆高。经多次分裂，多层分裂球迭加如桑葚，在动物极隆起呈小丘状(图3(c))。卵裂局限在动物极所在半球，分裂球的大小相近，高度约占整个卵垂径的1/3以上，整个卵裂期持续约3 h。胚胎多层分裂后分裂球难以分辨，胚层隆起较高，即囊胚早期(图3(d))。随着胚层的变薄并逐渐下降，卵黄囊内网状结构物质减少直至消失，整个胚胎呈正圆球形，囊胚期结束，时间持续190 min(图3(e)和(f))。原肠期胚层以内卷和下包的方式形成原肠胚。胚层下包1/2、2/3～3/4和4/5分别为原肠早期、中期和晚期，时间持续210 min(图3(g)、(h)和(i))。当胚层下包8/9，胚基形成后胚孔封闭(图3(j))。卵受精后约17 h，胚胎出现侧条眼基痕迹，肌节4对(图3(k))，有些胚胎明显可见被一层似膜结构包裹着，约90 min后眼基扩大成豆形眼囊，肌节7对(图3(l))。胚胎发育约25 h后，尾段伸展形成尾鳍，卵黄囊被略拉长，肌节23对(图3(m))；持续发育3 h后，在体视显微镜下可见胚体轻微抽动，卵黄囊前部圆球形，后段随尾生长而进一步拉长(图3(n))。卵受精后34 h左右，心脏形成并缓缓博动(图3(o))。卵受精后约51 h，眼囊变灰色，其正下方有一极小黑色素点，卵黄囊背前出现浅的黑色素化(图3(p))，约8 h后眼全黑，体各部出现黑色素，卵黄囊背面黑色素加深(图3(q))。卵受精后72 h，80%仔鱼孵出(图3(r))，96 h时100%仔鱼孵出。刚孵出的仔鱼，体呈草黄色，卵黄囊前部圆球形，后段细棒状，眼睛全黑，体表黑色素密布，胸鳍的大小和幼鱼的接近，鳃弧形成，口裂出现，消化道贯通并出现鳔雏形。

有的未受精卵产生不规则卵裂，不能继续发育；有的则不产生卵裂。约在同批受精卵发育至2～4细胞时开始，至囊胚期前后，陆续有未受精卵胚盘向卵黄囊中下陷直至湮没，卵黄囊随之变形、解体，整个过程约2 h(图4)。

当水温为(25±0.5) ℃时，稀有鮈鲫孵化时间约为75 h；当温度变化在22.0～28.0 ℃时，所需时间为89 h[9]；斑马鱼在25 ℃条件下，其胚胎孵化时间约为88 h[16]。因此，稀有鮈鲫胚胎发育时序及特征符合胚胎试验观察的需求，与斑马鱼基本一致，可在特定的时间点观察特定表征[17-18]。此外，在胚胎急性毒性试验要求的温度下(25～27 ℃)，稀有鮈鲫胚胎孵化时间<96 h，满足试验周期内空白对照组孵化率≥80%的要求。

图4 体视显微镜下分裂异常的稀有鮈鲫胚胎Fig. 4 Embryo of Gobiocypris rarus with abnormal division under stereoscopic microscope

综上所述：稀有鮈鲫作为卵生鱼类，在光照周期颠倒条件下，其自然受精率与孵化率均较高，具有开发胚胎毒性试验的潜力。其胚胎的形态特征(卵大透明，沉降于容器底部)满足胚胎试验观察的需求，可在特定的时间点观察特定表征；此外，稀有鮈鲫胚胎温度适应性广，有研究表明，稀有鮈鲫在水温13.0～31.6 ℃均能完成正常胚胎发育，通过控制水温，可提高或延迟其孵化时间[8]，这为稀有鮈鲫用作胚胎研究的试验材料提供了便利。在鱼类胚胎试验要求的温度下((26±1) ℃)，稀有鮈鲫胚胎孵化时间<96 h，且孵化率超过80%，满足鱼类胚胎试验对受试生物生命周期的界定以及试验有效性。