姬海南，李海山，宋乃宁，徐宝梁，赵潺，李文涛，沈国林

中国检验检疫科学研究院化学品安全研究所，北京 100123

目前，环境污染已经是一个全球性的话题，尤其是随着工业化生产的进一步发展，工业污染物大量排放，恶性肿瘤、遗传性疾病以及男性不育等疾病发生率逐年上涨，严重威胁着人类健康。环境内分泌干扰物(environmental endocrine disrupters, EEDs)亦称环境激素，是一大类存在于环境中的外源性化学物质，大多具有类雌激素样作用，能够破坏机体内环境的稳定和协调，干扰内分泌系统的正常发育[1-2]。双酚A(BPA)是备受关注的内分泌干扰物之一，具有弱雌激素效应[3-4]，能扰乱人类和野生动物的内分泌系统的正常功能，损伤再生机能和产生恶性肿瘤，从而可能对人类健康和野生动物构成极大的威胁[5]。BPA是生产聚碳酸酯塑料和环氧树脂的主要原料[6-7]，BPA不与聚合物的大分子共价结合，并且易于迁移到食品和饮料中[8-11]。BPA通过口腔和皮肤等途径进入动物或人体内后[12]，将干扰机体内分泌系统的功能，影响机体内的激素代谢，进而对机体的生殖、发育和认知甚至恶性肿瘤的发生等多方面产生影响[13-17]。目前，BPA的低剂量效应备受关注，但其毒作用机制尚不清楚，因此，研究低浓度BPA对小鼠内源性物质的影响对其引起的健康风险的评估具有重要意义。

近年来，代谢组学技术已广泛应用于环境毒理作用机制的研究[18-19]。使用高分辨质谱进行代谢组学分析，生物样品不需要衍生化，并且能够检测众多的化合物，已成为非靶标代谢产物分析的有效方法。采用超高效液相色谱-质谱联用(UHPLC-MS/MS)[20-22]法进行不同染毒剂量BPA的代谢组学研究的相关报道较少，因此，本研究采用代谢组学技术，寻找与BPA相关的生物标志物，并分析BPA对小鼠紊乱代谢通路的影响，揭示小鼠体内可能受到影响的代谢途径，以期进一步阐明BPA对机体的毒性作用机制，同时，寻求BPA的潜在生物靶点，为BPA毒性的有效快速检测提供一种新方法。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 仪器与试剂

DV215CD电子分析天平(Sartorius公司，德国)、电子天平(Mettler Toledo公司，瑞士)、-80 ℃冰箱(Thermo Fisher公司，美国)、DIONEX Ultimate 3000超高效液相色谱仪(Themo Fisher公司，美国)、Thermo Q EXACTIVE质谱仪(Themo Fisher公司，美国)、C18(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm)色谱柱(Thermo Syncronis公司，美国)、Milli-Q AdvantageA10型超纯水仪(Millipore公司，美国)、KQ-250超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，中国)和X-30R型离心机(Sigma公司，德国)，甲酸(色谱纯)、甲酸铵(色谱纯)、甲醇(色谱纯)和乙腈(色谱纯)均购自美国Themo Fisher公司。

1.2 实验动物

C57BL6小鼠，雄性，体重约18～22 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，小鼠饲养于SPF级动物房中，实验前禁食24 h，自由饮水。

1.3 染毒实验

小鼠适应性饲养结束后，设置1个对照组和4个实验组，染毒剂量分别为1、10、50和250 μg·kg-1，每天灌胃染毒一次，连续14 d。末次染毒后，空腹，眼球静脉取血放置于预放肝素钠的离心管中，5 000 g离心10 min，取血浆冻存于-80 ℃冰箱。

1.4 血浆样品处理

分析前将血浆样品于室温下解冻，取50 μL，加入乙腈450 μL，涡流30 s，13 000 r·min-1离心15 min，取上清液直接进样分析。

1.5 色谱条件

Dionex Ultimate 3000超高效液相色谱仪，色谱柱为Thermo Syncronis C18 (2.1 mm × 100 mm, 1.7 μm)；流动相A为水(含0.1%甲酸(体积比)和2 mmoL·L-1甲酸铵)，流动相B为乙腈；梯度洗脱条件：0～1 min，95% A；1～5 min，95%～40% A；5～8 min，40%～0% A；8～11 min，0% A；11～14 min，0%～40% A；11～15 min，40%～95% A；15～18 min，95% A。

1.6 质谱(MS/MS2)条件

电喷雾离子源(ESI)，采用正负离子同时扫描模式，电喷雾电压2.8 kV；鞘气流速为35 arb，辅助气流速为10 arb，毛细管温度320 ℃；一级全扫描(full scan)：分辨率为70 000，扫描范围为50～1 050 (m/z)；二级数据依赖性扫描(full MS/dd-MS)：分辨率为17 500，Stepped NCE值为20、40和60 V。

1.7 数据处理及分析

采用mzcloud对小鼠血浆内源性代谢物质进行鉴定，利用分子式和分子量及二级离子碎片确定内源性物质，同时在Trace Finder软件中自建内源性物质[22]，在Metlin(http://metlin.scripps.edu/)、HMDB(www.hmdb.ca)[23]和KEGG[24-25](www.genome.jp/kegg/ligand.html)数据库中进行检索和确认。本实验采用Meta boanalyst 3.3.0进行主成分分析(principal component analysis, PCA)、偏最小二乘判别分析(partial least squared discriminant)和拓扑分析，使用R统计软件包进行分析(R×64 3.2.4(http://cran.r-project.org))，从而进行高通量代谢通路分析[26]。最后用Cytoscape(http://www.cytoscape.org)、Metsape和MCL或MCODE(http://bad erlab.org/Software/MCODE)插件绘图并进行内源性物质网络图模块化分析。

2 结果与分析(Results and analysis)

2.1 血浆总离子图及鉴别方式

血浆样品总离子图及鉴别方式，如图1所示。

图1 (a)一级正离子全扫描特征的血浆样品总离子流图；(b)一级负离子全扫描特征的血浆样品总离子流图；(c)缬氨酸色谱图；(d)缬氨酸相应的精确质量数和分子式Fig. 1 (a) Total ion current chromatography (TIC) of plasma samples derived from positive ion scanning; (b) Total ion current chromatography (TIC) of plasma samples derived from the negative ion scanning; (c) Valine chromatogram; (d) The exact mass and molecular formula of valine

2.2 多变量分析各组小鼠血浆UHPLC-MS/MS数据的模式识别

2.3 潜在生物标志物的鉴定

PLS-DA分析后，结合VIP>1及P<0.05的筛选条件筛选出潜在的生物标志物。并与文献进行比较，共鉴定出27个潜在的生物标志物，其质谱数据信息如表1和表2所示。

表1 主要内源性代谢物的平均变化(VIP>1)Table 1 The average changes of main metabolites (VIP>1)

与对照组相比，各个染毒剂量组中亚油酸、β-羟基丁酸、棕榈酸、二十二碳六烯酸、胆固醇硫酸盐、花生四烯酸、十六烷丙氨、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、三甲胺N-氧化物、亚精胺、丙三羧酸和丙酮酸的含量均明显降低，并随剂量的增加，降低趋势更加明显，L-缬氨酸、丁烯基肉碱、3-甲基-2-氧戊酸、谷氨酰胺、L-乙酰肉碱、L-亮氨酸和肌酸的含量均明显升高，并随剂量的增加，升高趋势更加明显；植物鞘胺醇和β-羟基异戊酸的含量，随剂量的增加，先升高后降低；亚油酸肉碱、尼克酰胺的含量，随剂量的增加，先降低后升高。这些代谢产物的变化差异预示着小鼠经受不同剂量BPA暴露后，机体代谢功能发生了紊乱。

2.4 血浆数据的相关性分析与分层聚表类分析

2.4.1 血浆差异性代谢物相关性分析结果

血浆中27个差异性代谢物相关性分析结果如图3所示，图3中水平轴和垂直轴均代表内源性物质的变量信息，颜色越深反映其内源性物质的相关性越强，颜色越浅反映内源性物质的相关性越弱，棕红色表示正相关，蓝绿色表示负相关，因此，由图3可知差异性内源性代谢物之间的相关性。从横轴看，在同一小分支下的内源性物质，它们的正相关性最强，即某一个内源性物质含量升高或者降低，则与之相关性强的内源性物质会随之升高或降低。

表2 血浆内不同内源代谢物的相关检测信息(VIP>1)Table 2 The related detection information about different endogenous metabolites in plasmas (VIP>1)

图2 (a)四级杆静电场轨道阱高分辨质谱(Q-Exactive Orbitrap-MS)代谢组学数据的主成分分析(PCA)模型的分析结果；(b)代谢组学数据的偏最小二乘法判别分析法(PLS-DA)的分析结果Fig. 2 (a) Principal components analysis (PCA) score plots for comprehensive metabolomic data of Q-Exactive Orbitrap-MS; (b) Partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) models for metabolomic data of plasma samples

图3 生物标志物的相关分析结果(欧几里德距离测量法和沃尔德聚类算法)Fig. 3 Relevant results of biomarker analysis (distance measure using Euclidean, and clustering algorithm using Ward)

2.4.2 分层聚类分析结果

分层聚类分析获得的热图如图4所示，其可直观显示出27种代谢物在各组间的含量相关性。图4中纵向是样品的聚集，横向是代谢物的聚类，聚类枝越短代表相似性越高，从纵向聚类可以看出样品间代谢物含量的表达模式聚类。颜色深浅反映代谢物之间相关性大小，红色表示正相关，绿色表示负相关。由图4可知，对照组与其他各组显著分开，各组均不在一个分支下面，其中对照组、各个剂量组之间没有重叠，随着染毒剂量的增加，各组逐渐远离对照组，表明BPA暴露后小鼠血浆部分内源性代谢模式发生改变，从一定程度上说明BPA能够影响小鼠的代谢。

图4 Heatmap分析各组相关的生物标记物的结果(欧几里德距离测量法和沃尔德聚类算法)Fig. 4 Heatmap analysis of related biomarkers of each group (distance measure using Euclidean, and clustering algorithm using Ward)

2.5 潜在生物标志物的代谢通路分析

利用Metabo Analyst网站对27个代谢产物进行代谢通路的富集分析，选择KEGG作为数据库，代谢通路影响值的临界值设置为0.10，高于这个值，认为是潜在的靶标路径，共得到6条相关的潜在代谢靶标路径。它们分别为亚油酸代谢、花生四烯酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸及谷氨酸代谢、丙酮酸代谢、鞘脂类代谢和磷酸肌醇代谢。如图5和表3所示，在BPA染毒的过程中上述6个代谢通路受到了较大干扰。

图5 使用MetPA数据库构建重要内源性小分子相关代谢通路注：logP表示代谢通路贡献值的对数(log)转换。Fig. 5 Pathway analysis diagram obtained by MetPA showing effect of important endogenous substances on metabolic pathwaysNote: logP is the logarithm value of pathway impact.

2.6 潜在靶点网络模块化的构建及分析

网路中的模块具有相似性，通过跨模块化连接到网络中相邻模块中各个模块的节点，从而导致模块边缘之间的重叠。网络模型可以表达网络药物、目标和疾病之间复杂的关系；节点代表实体如基因、蛋白质、小分子、药物和疾病；连线代表节点之间的相互作用分析通过Cytoscape可视化中的Metscape模块化进行，共发现7个模块，其中的中心圆模块与其他6个模块联系最为紧密(图6)，其中，亚油酸与丙酮酸的连线有6条，L-谷氨酰胺与丙酮酸的连线有5条，L-谷氨酰胺与L-亮氨酸的连线有3条，L-谷氨酰胺与尼克酰胺的连线有2条，花生四烯酸与3-甲基-2-氧戊酸连线有3条。这说明，丙酮酸与之中心的模块关系最紧密，亚油酸次之。在利用Metscape重建与BPA染毒相关的代谢网络的基础上，可确定所有相关代谢物。可见，此法可有效筛选出节点药物的作用靶点。

3 讨论(Discussion)

本研究借助UHPLC-MS/MS高灵敏检测平台尝试从代谢潜在靶点的角度阐明这一复杂的病理生理过程。对这些差异代谢物的监测有利于进一步理解BPA对小鼠的毒性机制。

在差异代谢物中，与氨基酸代谢相关的化合物有谷氨酰胺、缬氨酸和L-亮氨酸。谷氨酰胺(L-glutamine, Gln)作为人体内最为丰富的氨基酸之一，为供能和生物合成提供主要的碳源和氮源，具有维持机体氮平衡、保护肠黏膜屏障及改善免疫功能等多种生理生化作用。有研究表明，Gln可改善肥胖机体糖脂类代谢，升高脂联素(APN)水平，改善胰岛素抵抗指数(IRI)[27]；经脂多糖(LPS)刺激的巨噬细胞分泌IL-6和TNF-α的量依赖于细胞外Gln的可用量[28]。异亮氨酸、缬氨酸转化成为葡萄糖后氧化分解，为机体提供必要的能量，参与修复组织、调节血糖和提升体能等。与对照组相比，各剂量处理组中，Gln的含量出现了显著性上调。Gln是神经兴奋递质，含量的上调表明BPA暴露使小鼠处于一种缺氧的状态[29]，并有可能导致神经系统的兴奋性中毒[30]。L-缬氨酸、亮氨酸的含量出现了显著性上调。已有研究表明，支链氨基酸对于肿瘤细胞的生长和增殖发挥重要作用[31]。因而，支链氨基酸的含量上调可能指示了对小鼠高风险的身体伤害。另一方面，已知支链氨基酸可调节能量代谢[32]。这些代谢产物的异常表明BPA可以扰乱小鼠体内氨基酸代谢。

表3 MetPA分析代谢通路的结果(Impact>0.10)Table 3 Results from pathway analysis with MetPA (Impact>0.10)

图6 用Metscape可视化模块化地图观察7个模块之间的连接注：节点的中心圆表示模块，它们之间的边表示模块之间节点的交互，外部中心圆是每个彩色节点的特定模块，深红色节点是模块的核心节点。Fig. 6 Module interactions visualization by the modular map obtained by Metscape to observe the connections among 7 modulesNote: Center circle of the node represents a module, and the edge between them represents the interaction of nodes among the modules; outside center circles are the specifc modules for each colored node, and the crimson nodes are the core nodes for the module.

脂类代谢包括脂肪酸生物合成、脂肪酸伸长、脂肪酸降解、酮的合成和类固醇生物合成、花生四烯酸代谢和初级胆汁酸合成等多种途径。β-羟基丁酸(β-hydroxy butyric acid, BHB)可代替葡萄糖为大脑提供能量[33]，也有研究表明，β-羟丁酸可减轻多巴胺能神经元的变性并可改善线粒体呼吸功能[34]。大量的脂类及其衍生代谢物在本次研究中被检出，其中，油酸、棕榈酸、二十二碳六烯酸、油酸、β-羟基异戊酸、丙三羧酸、花生四烯酸、尼克酰胺、亚油酸肉毒碱、11-十八烯基肉碱和丁烯基肉碱。染毒后，观察到亚油酸、棕榈酸、二十二碳六烯酸、油酸、β-羟基异戊酸、丙三羧酸、花生四烯酸、尼克酰胺、亚油酸肉毒碱、11-十八烯基肉碱和丁烯基肉碱大量减少，分析可能是因为细胞生物膜持续被破坏，无法及时修复所致，而部分脂肪酸的减少加重了机体脂质代谢的异常。这与BPA可能会通过干扰内源激素来影响脂肪代谢的结果相一致。

三甲胺-N-氧化物(trimethylamine-N-oxide, TMAO)是肠道微生物和膳食磷脂酰胆碱的代谢产物，胆碱代谢与脂类代谢关系密切，胆碱也是细胞膜和磷脂脂蛋白的重要组成成分，对细胞膜保持完整性及脂类代谢发挥着重要作用[35-36]，同时，胆碱也参与脂肪代谢的平衡调控，其含量升高也是脂代谢紊乱的证据。三甲胺N-氧化是由胆碱和肉碱在肠道细菌酶作用下的降解产物，BPA各剂量组中三甲胺含量降低，表明肠道菌群代谢可能发生紊乱。

亚精胺是一种天然多胺，在神经系统中具有调控突触可塑性、拮抗氧化应激和促进自噬的作用，亚精胺不仅参与细胞增殖、细胞衰老、器官发育、免疫以及癌症等病理生理过程，在神经系统中还具有调节突触可塑性、抗氧化应激及促进自噬等功能。与对照组相比，各个BPA剂量组中，亚精胺的含量明显降低，且剂量越高，降低趋势越明显，亚精胺代谢的异常预示BPA对机体神经系统产生了影响，这与文献中BPA能够引起小鼠认知及记忆功能障碍的报道互相印证[37]。

本研究表明，不同剂量的BPA能够影响小鼠亚油酸代谢、花生四烯酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、丙酮酸代谢、鞘脂类代谢和磷酸肌醇代谢，其毒性机制具有多通路、多靶点的特点。但本研究只观察了血浆的代谢组学特征，需进一步开展尿液、各个脏器及不同周期染毒样本的研究，以便准确反映BPA的毒性作用机制。