毛永建，李华

北京市医疗器械检验所 （北京 101111）

近年来，随着科学技术水平的提高，医疗器械产业 迅速发展，医疗器械生物安全性评价试验越来越完善。植入性局部反应试验是医疗器械生物安全性评价的重要试验项目，其中很多齿科材料、骨科材料、血管支架等器械材料的组分是钛、镍、镁等金属材料或高强度的高分子聚合物，使得普通石蜡切片技术已经无法满足组织制片的需求，而硬组织切磨技术的出现弥补了这一短板[1]。本研究以EXAKT 硬组织切磨设备为例，阐述制备硬组织磨片的技术方法及操作要点（目前，市场上制备硬组织磨片的设备有多种，其中大多数制作方法与EXAKT 切磨方法大同小异，制作步骤亦可参考此方法）。

1 设备与材料

1.1 设备

EXAKT 切磨系统。

1.2 试剂

10%中性甲醛、梯度乙醇、Technovit 7200VLC 光固化树脂、Technovit 7210VLC 精密粘合树脂、Technovit 4000冷固化树脂。

2 方法

2.1 固定与分切

在标本取材后，应立即将其放入10%中性甲醛固定液中（pH 为7.0）初固定1～2 d，固定液与组织的比例至少为10:1。

在较大组织标本初固定后，精确定位所需观察的组织或植入物，用E300CP 组织切片机分切成小且薄的组织块，继续固定（以5 mm 厚度为例，继续固定1～2 d）；如果是较大的动物组织标本或植入物，无法分切得很薄，则固定时间应成倍增加，但若固定时间过长，甲醛会呈弱酸性，影响后期的染色。

2.2 脱水

乙醇浓度梯度为70%、80%、90%、95%、100%、100%。为防止组织块收缩过快，要从低浓度的乙醇开始脱水，并根据组织块的种类、大小薄厚等确定脱水时间。表1是一块含金属材料骨组织的参考脱水时间。

表1 体积为1 cm3含金属材料骨组织的脱水时间

同等体积的肌肉和皮肤植入组织的脱水时间略短于骨植入组织，其中低浓度的乙醇脱水时间相对较长，高浓度的相对较短。当组织块过大过厚时，应间断进行负压抽真空处理，根据实际情况观察组织脱水的状态，灵活调控时间。

2.3 浸透

将脱水后的标本逐级浸入无水乙醇/7200VLC 光固化树脂中，具体时间根据样品调整。表2是体积为1 cm3含植入物肌肉组织的浸透时间。

表2 体积为1 cm3含植入物肌肉组织的浸透时间

同等体积的骨或皮肤植入组织的浸透时间可参考肌肉植入组织。为了使7200VLC 光固化树脂更好地浸透到组织中，间断进行抽真空处理非常必要。因浸透前期组织块中含有无水乙醇，所以长时间抽真空很可能使组织龟裂。如无抽真空设备，表2中抽真空的步骤会导致浸透时间延长1～2 d。一旦浸透不好，切磨片时组织块表面会有很多空腔或造成样品、组织脱落，因此，不建议浸透时间太短。

2.4 包埋

使用光固化包埋机低强度光源（黄光），使包埋介质进一步聚合，时间需要4～6 h，环境温度应低于40 ℃[2]，如此得到的树脂胶硬度较高且固化较稳定。

使用蓝色光源，使浸透到组织内的包埋介质完全固化，时间为8～12 h。

包埋时要选择合适的包埋模具，为节省空间及时间，如果组织标本块较小，则可以在一个包埋模具中同时包埋数块组织，但一定要标记好每一块组织的摆放位置且确保位置适当，方便后期分切。

2.5 组织标本块基座的制作

将玻璃载片吸附在真空粘合压片器上，然后使用Technovit 4000冷固化树脂将组织标本块固定在玻片上，注意Technovit 4000冷固化树脂Ⅰ液:Ⅱ液:粉末的最佳比例应为2:1:3，如果比例恰当，Technovit 4000会很快固化，若搅动不充分固化，会导致磨片时遇水粘合不牢，可以先将两种液体混合均匀，然后加入定量的白色粉末中，用搅拌棒快速充分搅动。需要注意的是，因Technovit 4000有毒有害，所以操作最好在通风良好的环境中进行，并佩戴护具。

对组织标本块进行初步研磨，露出所需观察的组织面，如果观察到组织面有空腔或裂纹，则使用E530型干燥聚合修复装置，在组织表面滴上7200VLC 树脂（量不宜太多，铺满组织面即可），然后进行负压抽真空，再修复固化1次；修复后，待组织块完全干燥再进行研磨等操作，否则会有7200VLC 残留成分或残留样品，待染色后，于镜下观察有油污状污染物，会影响阅片[3]。

在E400CS 组织磨片机上用砂纸（320、500、800、1 200、2 500、4 000目等）将附有下载片的标本块组织面研磨成光滑均匀且与玻璃载片平行的平面，露出所需观察的组织及植入物。对于带有金属植入物的组织标本块，研磨速度要慢，砝码选择要小，从320目砂纸开始逐步研磨，确保抛光后金属面与组织面薄厚一致[每次更换砂纸前组织面要用数显千分尺测量至少4个点位（每个点位之间的测量值之差应≤5 μm），取平均值]。值得注意的是，为了确保磨片机的稳定，要提前开机预热空转30 min；为了确保砂纸与磨盘贴合的更好更平整，砂纸需要提前在水中浸泡1～2 h，注意时间不宜过长，以免影响砂纸的锋利度。制备好的组织块基座见图1。

2.6 附加平行载片

因树脂载片不易碎，且与Technovit 7210VLC 精密粘合剂及组织标本块结合得更好，所以应选择树脂载片作为平行载片，但其成本及淘汰率较高，且因采购到的树脂片工艺水平差异较大，易出划痕，导致表面不平整（误差在5 μm 以上），所以要求精确测量其厚度。

图1 组织标本块的基座

将平行载片吸附在EXAKT 平行粘合压片机上，然后用Technovit 7210VLC 精密粘合剂粘在平行组织面上（注意防止产生气泡），打开光源，开始固化，时间为10～15 min，注意粘时要确保取粘合剂的器械、组织面、平行载片的表面的清洁，见图2。

需要注意的是，由于7210VLC 粘合剂呈弱酸性，接触含“镁”等活性金属时会产生大量气泡，因此，不能被用于粘接该类样品[4]。

图2 附加平行载片的结构

2.7 计算胶的厚度

为保证最终制片的准确厚度，需使用数显千分尺精确测量并计算出附加好平行载片后7210VLC 粘合剂的厚度，测量及计算方法见图3。

图3 组织块的结构

需要注意的是，测量的所有步骤都应保持在同一温度下，且根据组织面的大小选择测量点位数量，组织面越大则测量点位应越多，一般为4～5个点，求平均值。

2.8 切片

使用E300CP 硬组织切片机，将有树脂平行载片的一面切割成厚度为100～200 μm 的切片，且不宜太薄，因切片后续要经过多道砂纸逐步研磨，太薄会给每道砂纸研磨的控制带来困难；亦不宜太厚，因有的样本块可能需要制备多张切片，太厚会浪费包含植入物的组织。由于设备的参数设置并不能精准地控制切片的厚度，所以，切片的厚度在很大程度上取决于个人经验的积累。

切片带锯和支撑轮组装是否到位及选择的带锯是否合适都会直接影响切片的平整度，如果切片前后凹凸不平，则考虑是由于设备组装不到位或带锯不够锋利导致。在切割过程中，切割台下有50～100 g 的推动力，在切片过程中任何外力都会导致切割面凹凸不平。当带有金属植入物的组织或组织块较大时，带锯的转速和摆动速度均要慢，且应选择较小的推动力。

2.9 磨片

用数显千分尺测量、计算组织的准确厚度，根据所测量厚度调定需在磨片机上研磨的厚度；当切片很薄时，可省略320目砂纸研磨，选择500、800、1 200、2 500、4 000目的砂纸磨片至需要的厚度为止；需要注意的是，研磨到2 500 目时要格外小心，因为到2 500 目时切片的厚度已接近预设值，进一步需要的研磨量已很难由设置参数来控制，需依赖自身经验去设定研磨时间，极端情况下，受研磨时冷却水的影响，可能会出现片子被机器紧密吸附，导致组织和植入物在极短时间内被全部磨掉的情况。4 000目砂纸起抛光的作用，设定时间可以长一些，可为7～10 min 或更长。

2.10 染色

常用染色法包含HE 染色法、甲苯胺蓝染色法及亚甲基蓝-酸性品红染色法，我们可以根据所需观察的指标选择不同的染色方法。HE 染色法的步骤与常规石蜡切片HE染色法基本一致（去掉脱蜡部分），但固化后的树脂不易上色，可根据组织标本块种类、厚度、大小的不同来适当延长染色时间，如普通石蜡切片HE 染色中苏木素染色时间需要5～10 min，而硬组织磨片需要20～30 min 或更长；待每个步骤完成后，均需于镜下观察染色效果，若效果不佳，则需复染并根据经验调整时间；不同的组织、不同厚度的磨片染色时间存在差异，只有及时进行镜下观察及持续积累经验，才能不断提升硬组织磨片染色的质量。

3 讨论

与石蜡切片技术比较，硬组织切磨技术的优点：（1）不用脱钙，众所周知，脱钙程度不好把控，时间过长可引起组织细胞皱缩而造成组织结构不完整[5]，对于一些含钙较高的医用材料，脱钙可破坏组织结构，影响其生物学评价及定量分析；（2）可以做到原位切片，对于一些植入后局部反应试验，很多医用金属或其他材料（如钛、镁等金属材料、带螺纹的牙科种植体及一些不规则的医用材料等），石蜡切片无法做到原位切片。硬组织切磨技术的缺点：（1）成本高，设备、带锯、砂纸、树脂及树脂载片等主要耗材均需专机配套使用，价格较石蜡切片高很多；（2）周期相对长，一张标准的硬组织磨片从固定到浸透到最终制作成片再到染色至少需要2个月，如组织标本块过大或过厚还需再延长时间；（3）步骤繁多，每一步都需精雕细刻，时间无法省略或缩短；（4）硬组织磨片相对较厚，普通石蜡切片可以控制在3～5 μm，但硬组织制片终厚度在20～50 μm，由于其材料的特殊性和设备的不稳定性，过薄的切片不易染色且易造成组织及样品缺失。

总之，硬组织切磨技术是医疗器械生物安全性评价的重要技术手段。制作一张标准的硬组织磨片周期跨度很长，全程操作步骤均不可逆，且每个硬组织标本块最多只可切几张切片，每一张都很珍贵，因此，每一步操作都要到位，谨慎细心，精准控制时间，避免失误；此外，操作技术人员需要不断地学习和实践，积累丰富的制片经验。

［参考文献］

［1］ 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会. GB/T 16886.6-2015.医疗器械生物学评价第6部分：植入后局部反应试验[S/OL]（2015-12-10）[2017-04-01].http：//www.doc88.com/p-5955645962139.html.

［2］ 葛丽华，杨晶.硬组织磨片的制备[A].中华医学会病理学分会2011年全国病理技术新进展研讨会论文汇编[C].南宁：中华医学会，2011：158-159.

［3］ 席越.骨组织病理解剖学技术[M]. 2版.北京：人民卫生出版社，2009：185-186.

［4］ 王东胜.硬组织制片技术要领及应用[DB/OL].全国第二届硬组织切磨技术应用培训班.

［5］ 齐进，黄萍，张连方，等. EXAKT 切磨系统在带金属种植体软硬组织切片中的应用[J].中国组织工程研究，2012，16（35）：6557-6558.