张德宝 宋龙飞 梁忠祥 刘 佳

（1河北韩美生物科技有限公司，河北保定 071000；2河北正合生物制药有限公司，河北石家庄 050000）

猪圆环病毒（porcine circovirus,PCV）属于圆环病毒科圆环病毒属，包括猪圆环病毒I型（PCV1）和猪圆环病毒2型（PCV2），一般认为PCV2具有致病性。与其他几种猪的传染病有关，包括PMWS（断奶仔猪多系统衰竭综合征）、PDNS（皮炎肾病综合征）、PRDC（猪呼吸道病综合征）等，我国最早在2000年证实有该病毒的存在。此后，由该病引起或诱发的猪相关性疾病，对国内外养猪业均造成了严重的经济损失。目前，针对该病暂无有效的治疗措施，疫苗预防仍是该病最有效的防治手段。

目前，国内外已经成功开发出多种针对PCV2的疫苗，其中以亚单位疫苗、全病毒灭活疫苗为主，在其中佐剂发挥着至关重要的作用。同时多数文献报道，疫苗中添加合适的抗原稳定剂，有助于提高抗原本身的稳定性，对于疫苗免疫效果亦有显著提升作用。本研究使用PCV2全病毒灭活抗原，与市场应用良好的佐剂和抗原稳定剂乳化制备疫苗，在小鼠上进行免疫效果评价，目的是筛选出能够更好地增强PCV2灭活疫苗免疫效果的佐剂和组合，为疫苗的开发及效果优化提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 抗原

猪圆环病毒2型灭活抗原，猪圆环病毒检测用Cap蛋白，由某疫苗企业馈赠。猪圆环病毒PCV2灭活疫苗，购自上海勃林格殷格翰药业有限公司。

1.2 主要试剂

佐剂 1（ISA 206）、佐剂 2（ISA 201），由法国SEPPIC公司提供；双相佐剂3、4，由国内佐剂公司提供；水包油佐剂5，由国内某佐剂公司提供。抗原稳定剂，市售。TMB单组份显色液、HRP标记羊抗鼠IgG抗体，购自Sigma-Aldrich公司。

1.3 试验动物

4～6周龄SPF级BALB/c小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.4 灭活疫苗的制备

将灭活圆环病毒抗原与5种佐剂按照合适比例混合，按照各自佐剂使用方法（保证各组抗原含量相同，不足部分使用灭菌PBS补齐体积），在最优条件下乳化配苗，分别标记为1-1组、2-1组、3-1组、4-1组、5-1组。同时将抗原稳定剂A按照0.5%的比例加入到抗原相中，再乳化配苗，分别标记为1-2组、2-2组、3-2组、4-2组、5-2组。共10组疫苗。

1.5 小鼠免疫分组

将120只雌性BALB/c小鼠随机分成12组，每组10只。上述10组疫苗，0.2 mL/只。同时设置第6组为空白实验组，注射PBS 0.2 mL；第7组为“勃林格”疫苗对照组，0.1 mL/只。免疫后0 d、14 d、21 d、28 d，小鼠眼球采血测定其ELISA抗体水平。

1.6 间接ELISA方法

以碳酸盐缓冲液稀释抗原，100 μL/孔于4℃包被过夜；纯化水洗板3次，加入封闭液200 μL/孔，37℃封闭2 h，纯化水洗板3～5次，自然晾干。用样品稀释液稀释待检验鼠血清，100μL/孔加入酶标板中，37℃作用60 min，取出后PBST洗涤3～5次，拍干；加入酶标抗体工作液，37℃作用60 min，洗涤3～5次，拍干；加入TMB显色液，100μL/孔，室温避光反应10 min后，加入终止液50μL/孔；酶标仪读取OD450nm值。检测孔与阴性对照孔OD450nm值比率大于或等于2.1的最高稀释度的倒数为该血清的抗体效价。

2 结果

2.1 物理性状

制备的10组疫苗，外观均呈现乳白色均质乳剂；37℃静置3 d、25℃静置14 d均未出现分层及破乳现象；3 000 rpm离心15 min稳定性合格。

2.2 5种佐剂对猪圆环病毒灭活疫苗效果的影响

表1 不同佐剂制备的圆环病毒疫苗免疫小鼠后的血清抗体水平

由表1可知，不同佐剂制备的猪圆环病毒灭活疫苗，免疫小鼠后产生的抗体水平存在显著差异（P＜0.05）。对比1-1和2-1组结果可知，ISA 201佐剂产生的抗体水平显著高于ISA 206（P＜0.05）；同时市售佐剂3和佐剂4，免疫效果差异显著（P＜0.05），佐剂3可达到ISA 201水平，佐剂4免疫效果较ISA 206略差；佐剂5免疫效果介于佐剂2和佐剂3之间，说明水包油剂型佐剂应用于圆环病毒疫苗，免疫效果也比较理想。

2.3 抗原稳定剂对猪圆环病毒灭活疫苗效果的影响

表2 抗原稳定剂对猪圆环病毒灭活疫苗效果的影响

对比表1和表2结果，对于佐剂1/3/5而言，抗原稳定剂的使用可以显著提高小鼠血清抗体水平，效果差异显著。对于佐剂2/4而言，抗原稳定剂对于抗体水平的提升影响较小，差异不显著。

3 讨论

PCV2感染猪体后能够诱导机体产生体液免疫应答反应，在一定程度上可以认为，提高猪体对PCV2的体液免疫水平，有可能提升疫苗的临床使用效果，增强机体抵抗PCV2感染的能力。同样研究表明灭活疫苗确实具有较好的免疫保护作用。不同免疫佐剂和抗原稳定剂的配比，对于疫苗的免疫效果发挥的作用至关重要。本文对比了5种市场上常见的水性佐剂和1种常见的抗原稳定剂，对PCV2灭活疫苗免疫效果的影响，目的是找到免疫效果比较理想的组合和配比，为灭活疫苗的开发提供试验支持。

本研究中使用市场上应用效果较好的“勃林格”圆环病毒疫苗作为对照，通过对比小鼠血清中ELISA抗体水平，可以看出抗体水平在一定程度上反映出疫苗的免疫效果。本研究中使用不同的佐剂乳化PCV2灭活抗原免疫BALB/c小鼠后，测定小鼠血清中ELISA抗体水平，佐剂2、3、5产生的抗体水平显著超过其他试验组，说明这3种佐剂能够更好地诱发小鼠体内的体液免疫应答反应。同时开展抗原稳定剂验证试验，与佐剂3和佐剂5复配使用，抗体水平显著提升，对于开发新型高效的猪圆环病毒灭活疫苗，可以提供一定的数据参考。另外，本试验未在靶动物猪上开展效力性评价试验，可能无法真实反映在临床上的实际应用效果，以后有待于在猪体上进行更深入的研究。