梁 锋 徐文泱 - 赵红清 - 王 凯 刘漾伦 -

(1. 湖南省食品质量监督检验研究院，湖南 长沙 410017；2. 食品安全监测与预警湖南省重点实验室，湖南 长沙 410017)

偶氮型工业染料的提取溶剂多为无机酸、甲醇、丙酮、乙腈、乙酸乙酯、水[3-4]等，试剂的种类应根据目标物的极性进行选择；检测采用的净化手段有液液萃取[5]、固相萃取[6]、基质分散固相萃取[7]和凝胶渗透色谱技术[8]等。液相色谱及液相色谱质谱联用法以其高选择性和高灵敏度的特点，常被用来筛查和确证食品中的痕量工业染料[9-11]。Lim等[12]以C18SPE小柱对食品中的二甲基黄和二乙基黄净化，结合液相色谱进行检测，液相色谱质谱联用仪确证，定量限分别达0.09，0.14 mg/kg。Yoshioka等[13]采用聚酰胺粉小柱实现饮料、糖浆和糖果基质样品的净化，光电二极管阵列液相色谱仪检测水溶性色素红2G，其定量限可达0.1 mg/kg。Minioti等[14]以水为溶剂，稀释或超声提取饮料、果酱、糖果中包括红2G在内的13种合成染料，重点优化了流动相的选择和洗脱程序。目前尚未建立这3种工业染料在食品中同时测定的检验方法，为了加强对这种在食品生产经营活动中可能出现的非法添加行为的监管，国家市场监管总局在2019年公开征集食品补充检验方法需求后，根据重要紧急以及科学可行的原则进行筛选，并组织专家评审将调味品、豆制品和肉制品中二甲基黄、二乙基黄和红2G的检测方法列为目前急需建立的食品补充检验方法，以加强对食品安全案件调查、食品安全事故处置等工作的技术支撑，提高监管效能。试验拟建立3种工业染料在食品中的同时测定方法，采用液相色谱法定量，液相色谱—质谱联用色谱仪进行定性确证，旨在为监测监督此类物质的非法使用提供依据。

1 试验部分

1.1 仪器与设备

高效液相色谱仪：1260 Infinity型，美国Agilent公司；

液相色谱—质谱仪：Q Exactive Focus/U3000 Rs UPLC型，美国赛默飞世尔科技公司；

分析天平：CP214型，奥豪斯仪器(上海)有限公司；

旋转蒸发仪：RE-2000A型，上海亚荣生化仪器厂。

1.2 材料与试剂

水：GB/T 6682规定的一级水；

盐酸、无水硫酸钠、乙酸铵：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

乙腈：色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司；

红2G、二甲基黄、二乙基黄标准品：纯度99.9%，北京坛墨质检科技有限公司；

HLB固相萃取小柱：6 mL，300 mg，美国Waters公司。

1.3 样品前处理

称取5 g均质后的样品于50 mL离心管中，加入15 mL 盐酸酸化的50%乙腈—水溶液，涡旋混匀，4 500 r/min 离心2 min，重复提取一次后合并上清液，旋转蒸发至近干，以50%乙腈—水溶液定容至2 mL，上清液待净化。

HLB固相萃取小柱用3 mL乙腈活化，加入待净化液，弃去流出液；加入3 mL乙腈，弃去流出液，加入4 mL 10%氨水—甲醇，收集流出液。将流出液于50 ℃下氮吹至干，用50%乙腈—水溶液定容至1 mL，过0.22 μm微孔滤膜，供高效液相色谱分析。如实际样品中有检出，通过保留时间及DAD光谱图不能准确定性，可通过高效液相色谱—三重四极杆串联质谱法进行确证。聚酰胺粉小柱、DMY固相萃取柱、PSA小柱的方法分别参照文献[15-16]。

1.4 标准溶液配制

(1) 标准储备液：分别称取红2G、二甲基黄、二乙基黄各0.010 0 g于100 mL容量瓶中，用50%乙腈—水溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为100 μg/mL的标准储备液，0～4 ℃冷藏保存，有效期6个月。

(2) 混合标准中间液：分别准确吸取红2G、二甲基黄、二乙基黄标准储备液各5 mL于同一25 mL容量瓶中，用50%乙腈—水溶液稀释至刻度，摇匀。0～4 ℃冷藏保存，有效期1个月。

(3) 混合标准工作液：分别准确吸取不同体积的混合标准中间液，用50%乙腈—水溶液稀释成一系列标准工作液，临用新制。

1.5 色谱条件

色谱柱：C18(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)；流动相：A为0.02 mol/L乙酸铵，B为乙腈，洗脱梯度程序见表1；流速1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长：二甲基黄410 nm，二乙基黄418 nm，酸性红507 nm；进样量10 μL。

表1 色谱柱梯度洗脱程序

1.6 液相色谱—质谱条件

1.6.1 二甲基黄及二乙基黄液相色谱—串联质谱/质谱测定

(1) 液相色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC®BEH C1850 mm×2.1 mm，1.7 μm，进样量5 μL；柱温40 ℃；流速0.2 mL/min；流动相A为含0.1%甲酸+0.05 mol/L 乙酸铵—水溶液，流动相B为乙腈，按表2进行梯度洗脱。

表2 二甲基黄及二乙基黄液梯度洗脱程序

(2) 质谱条件：离子化方式为电喷雾电离；正离子扫描；多反应监测(MRM)；喷雾电压3 000 V；传输毛细管温度500 ℃；MRM模式下参数设置见表3。

表3 多反应监测模式下二甲基黄、二乙基黄的质谱参数

1.6.2 红2G液相色谱—串联质谱/质谱测定

(1) 液相色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC®BEH C1850 mm×2.1 mm，1.7 μm；进样量5 μL；柱温40 ℃；流速0.2 mL/min；流动相A为含0.05 mol/L乙酸铵—水溶液，流动相D为乙腈，按表4进行梯度洗脱。

表4 红2G的梯度洗脱程序

(2) 质谱条件：离子化方式为电喷雾电离；负离子扫描；多反应监测(MRM)；喷雾电压2 500 V；传输毛细管温度500 ℃；质谱参数设置见表5。

表5 多反应监测模式下红2G的质谱参数

将标准系列工作液按液相色谱参考条件进行测定，测定相应的色谱峰面积，以标准工作液的浓度(μg/mL)为横坐标，以色谱峰的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。按前述仪器条件测定样品和混合标准系列工作溶液，记录样品和混合标准系列工作溶液中目标物的保留时间。若样品中检出与混合标准系列工作溶液中待测物保留时间一致的色谱峰(变化范围在±2.5%内)，且其定性离子与浓度相当的标准溶液中相应的定性离子的相对丰度相比偏差不超过表6规定的范围，则可以确定样品中检出相应的待测物。

表6 定性确定时相对离子丰度的最大允许偏差

2 结果与讨论

2.1 仪器条件优化

二甲基黄、二乙基黄呈碱性带正电荷，以0.1%甲酸—水溶液和乙腈作为流动相峰形和信号灵敏度较好，红2G可电离出H+，用乙酸铵或甲酸铵—水溶液作为流动相出峰峰形较好。采用液相色谱质谱联用进行测定，当使用同一流动相时，3个化合物不能同时达到峰形良好的状态。而液相色谱法采用0.02 mol/L乙酸铵和乙腈为流动相时，峰形良好，无杂质峰干扰，3个峰得到较好的分

离。因此选用液相色谱法作为定量方法，当液相色谱法无法进行准确定性时，采用液相色谱质谱联用对其进行确证。由图1～3可知，流动相中二甲基黄、二乙基黄、红2G分别在410，418，507 nm处有最大吸收波长，因此分别选择这3个波长为检测波长。

1. 红2G 2. 二甲基黄 3. 二乙基黄

2.2 前处理条件优化

2.2.1 溶剂的选择 配制的标准溶液澄清透明，静置24 h 后无沉淀物或悬浮物，说明所选的溶剂对这3种色素的溶解性较好。

2.2.2 净化柱的选择 由图4可知，聚酰胺粉对二甲基黄和二乙基黄的回收率不高，可能是由于pH为3～4时，其对色素的吸附效果最好；DMY的固相萃取小柱更适合于二甲基黄和二乙基黄的检测，对于红2G的净化效果不理想；PSA固相萃取柱的平均回收率不高。HLB是一种亲脂性与亲水性填料混合的固相萃取柱[17-18]，其准确性较其他3种净化方式高。因此，在固相萃取柱的选择方面采用具有亲水性和疏水性的HLB固相萃取柱。

图2 红2G标准物质的总离子流色谱图和提取离子色谱图

图3 二甲基黄和二乙基黄的标准物质的总离子流色谱图和提取离子色谱图

图4 4种净化方式对不同食品类别中3种偶氮性化合物回收率的影响

2.3 基质效应的测定

基质效应是以液相色谱—质谱联用仪对复杂基质的痕量样品进行检测时应考虑的因素[19]。试验方法的研究对象为调味品、肉制品和豆制品，其蛋白质和脂肪易影响净化结果。选取3种不同的基质，其斜率比为80%～115%。因此可不考虑基质效应的影响。

2.4 线性范围和检出限

试验表明，二甲基黄的线性回归方程为Y=1.36×105x-7.03×103，相关系数r=0.999 8；二乙基黄的线性回归方程为Y=1.49×105x-8.66×103，相关系数r=0.999 7；红2G的线性回归方程为Y=2.07×105x+9.18×103，相关系数r=0.999 7，表明在5.0～100.0 μg/mL内呈线性关系，符合定量要求。当称样量为5 g时，红2G的检出限为0.5 mg/kg，二甲基黄、二乙基黄的检出限均为0.1 mg/kg。由此可知，采用此方法的检出限低，3种偶氮型化合物的线性良好。

2.5 回收率和精密度

由表7可知，调制品中的回收率为81.2%～90.5%，肉制品中的回收率为80.7%～91.8%，豆制品中的回收率为81.4%～85.2%。试验方法对加标食品中的3种偶氮型化合物检测具有理想的回收率和精密度。

表7 辣椒酱中红2G、二甲基黄、二乙基黄的回收率和精密度

3 结论

建立了同时测定调味品、肉制品及豆制品中红2G、二甲基黄和二乙基黄等偶氮性工业染料的液相色谱法和LC-MS/MS方法。结果表明，试验方法在0.1～10.0 μg/mL 内呈良好的线性关系，在添加浓度为0.000 5，0.001 0，0.005 0 mg/kg时的回收率为80.7%～91.8%，具有较为理想的回收率和精密度，满足新方法确认的技术参数要求，为进一步强化检验检测技术对食品安全监管的支撑作用提供了方法参考。后续可进一步增加偶氮型工业染料的数量，扩展研究的食品基质，建立多种工业染料的同时测定方法。