陈锃峄，陈清贵，龙竹梅，姚思羽，张贵锋，梁燕龙,2

1肇庆医学高等专科学校,广东肇庆 526061；2肇庆学院

2型糖尿病性骨质疏松症(T2DOP)是糖尿病在骨骼系统引起的严重慢性并发症，已成为常见的继发性骨质疏松症疾病，可导致骨折，给社会造成巨大的经济压力[1]。当前治疗骨质疏松的一线药物如二膦酸盐类可发挥一定的疗效，但长期应用会产生较多不良反应。而中药具有疗效确切、不良反应少和患者的认可度高等优势，从中药中寻找有效成分用于治疗骨质疏松成为近年来的研究热点。许多研究表明，芹菜素具有多种药理学活性，如抗氧化[2]、抗炎[3]、降血糖[4]和抗癌活性等。最新研究[5]表明，芹菜素对骨重建具有重要作用，对绝经后骨质疏松有良好的治疗效果。但是，芹菜素对T2DOP的作用少见报道。因此，2018年7月～2019年5月本研究探讨了芹菜素对2型糖尿病大鼠胫骨和腰椎骨密度的影响，为芹菜素防治T2DOP提供实验依据，从而为T2DOP的临床防治提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 动物、主要试剂和仪器 50只8周龄雄性SPF级SD大鼠，体质量180～200 g，购买于南方医科大学实验动物中心。所有大鼠饲养在普通级动物饲养房，实验室温度(22.0±3.0)℃，相对湿度(60.0±5.0)%，实验开始前所有动物进行适应性饲养1周，普通饲料喂养，不限制进食和饮水。芹菜素购自天津万象恒远科技有限公司；骨化三醇购自上海罗氏制药有限公司；链脲佐菌素购自美国Sigma公司。双能X线骨密度仪为Discovery QDR系列。

1.2 动物造模、分组及处理 50只SD雄性大鼠按体质量随机分为2组，分别是正常组(10只)和模型组(40只)。正常组给予普通饲料喂养，模型组给予高糖高脂饲料进行喂养[6]。造模1个月后，每只大鼠腹腔注射3%链脲佐菌素40 mg/kg，3 d后对大鼠进行葡萄糖耐受试验。在此期间对大鼠禁食、禁水10 h，之后记录其体质量；以20%的葡萄糖溶液对大鼠灌胃，控制剂量为5 mL/kg，记录大鼠的灌胃反应；在灌胃前及灌胃后0.5、1、2 h测血糖，从中选择餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L或空腹血糖≥7.0 mmol/L的30只大鼠纳入后续实验。该30只大鼠根据体质量排序分3个区间，通过软件得到30个随机数对应于体质量，对各组的随机数基于大小进行标序，所有相同标序号的为一组；据此将所有大鼠分为以下三组：模型组、芹菜素组、骨化三醇组，各组数量均等。芹菜素组以芹菜素50 mg/(kg·d)连续灌胃，骨化三醇组以骨化三醇0.045 μg/(kg·d)连续灌胃。芹菜素和骨化三醇不溶于水，用1%羧甲基纤维素钠配制成混悬液。正常组和模型组给予灌胃等体积1%羧甲基纤维素钠(5 mL/kg)，芹菜素组、骨化三醇组灌胃等体积相应药物，各组连续灌胃时间均为8周。实验结束后，处死所有大鼠。收集血液样本和骨组织，所有血液样本于4 ℃冰箱中静置4 h后离心(10 000 r/min,10 min)，吸取血清装入EP管-80 ℃保存待用。

1.3 观察指标 ①在实验期间，每2周测量各组大鼠的空腹血糖和体质量。实验前，所有大鼠隔夜禁食12 h以上，在次日早晨通过大鼠尾静脉采血的方式，运用血糖仪测定空腹血糖水平。②将置于-80 ℃冰箱的血清取出，并放在4 ℃环境下解冻，采用酶联免疫反应方法测定骨钙素(OCN)、Ⅰ型胶原C端肽(CTX-Ⅰ)和胰岛素(INS)水平。操作均按试剂盒说明书进行。③取大鼠胫骨和第2～5腰椎骨(L2～L5)，去除多余组织，将纱布用生理盐水沾湿，将样品按照一定的方法进行严密包裹，外面再包裹一层锡箔纸，确保样本组织湿润，之后将其放入冰箱冷藏，测定骨密度。从冰箱中取出胫骨和L2～L5，室温自然解冻，用双能X线骨密度仪测定骨密度。

2 结果

2.1 各组大鼠处理前后不同时间体质量比较 见表1。

表1 各组大鼠处理前后不同时间体质量比较

2.2 各组大鼠处理前后不同时间空腹血糖比较 见表2。

表2 各组大鼠处理前后不同时间空腹血糖比较

2.3 实验8周各组大鼠血清INS、OCN、CTX-Ⅰ水平比较 见表3。

表3 实验8周各组大鼠血清INS、OCN、CTX-Ⅰ水平比较

2.4 实验8周各组大鼠腰椎和胫骨骨密度比较 见表4。

表4 实验8周各组大鼠腰椎和胫骨骨密度比较

3 讨论

T2DOP是糖尿病在骨骼系统引起的严重慢性并发症，已成为常见的继发性骨质疏松症疾病，可导致骨折，给社会造成巨大的经济压力[1]。本研究制备的大鼠模型可以很好地模拟人类T2DOP疾病的性质和进展。本研究的结果已证实，该模型大鼠的空腹血糖升高，INS分泌增加，这些与2型糖尿病患者的主要症状相似。研究[8]发现，血糖升高可对多种体内的微量元素代谢造成影响，并且改变破骨细胞的活跃度。在此情况下，骨细胞的增殖、分化受到抑制，并进一步造成骨量的大量流失，从而对人体健康造成严重的损害。此外，糖尿病患者INS水平降低也与骨质疏松症骨脆性增加有关[9,10]。本研究结果也显示，高脂高糖饲料联合小剂量链脲佐菌素制备的2型糖尿病大鼠骨量下降，表明2型糖尿病大鼠骨形成受到抑制，松质骨出现骨丢失，导致骨量降低，其大鼠血清骨代谢指标OCN水平升高和CTX-Ⅰ水平降低也能解释上述的结果。

芹菜素是一种天然植物类黄酮，可降低血糖和改善血脂异常。研究[11]表明，芹菜素可以促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化。从这一角度出发，本研究探讨50 mg/(kg·d)剂量的芹菜素对2型糖尿病大鼠胫骨和腰椎骨密度的影响。既往研究已证实，该剂量能够对实验性糖尿病大鼠具有保护作用[4]，并缓解糖尿病并发症的发生。本研究结果可见，芹菜素能够明显降低2型糖尿病大鼠的血糖和INS水平，这与其他文献的研究[12]结果具有一致性，其作用效果与阳性药骨化三醇组相当。同时，在给药6周和8周时发现，芹菜素组大鼠体质量均高于模型组，这表明芹菜素发挥着降血糖作用，从而使葡萄糖不会从大鼠尿中过多丢失，加之大鼠食欲旺盛，导致大鼠体质量增加。2型糖尿病大鼠灌胃芹菜素8周后，大鼠血清骨代谢转换指标中OCN水平升高，CTX-Ⅰ水平降低，说明芹菜素能够促进骨形成、抑制骨吸收，有助于增加骨量。从医学上讲，骨密度与骨强度直接相关，也是诊断骨质疏松的标准；此外，也可以根据人体骨密度情况预测骨折风险[13]。根据相关研究结果显示，芹菜素能提高去势大鼠股骨骨密度，同时也可以一定程度的预防绝经后骨质疏松性骨折的发生[14]。本研究结果显示，芹菜素对2性糖尿病大鼠胫骨和腰椎的骨密度水平均有明显提升，其作用机制有可能与芹菜素具有调控Wnt/β-catenin通路表达的作用有关[15]，因为在糖尿病小鼠模型中，骨量的丢失与Wnt/β-catenin通路调控下降有直接相关[16]。

总之，芹菜素可提高糖尿病大鼠腰椎、胫骨的骨密度，这为芹菜素防治T2DOP提供了理论依据。但T2DOP发病机制相对复杂，本研究给药干预的时间仅8周，所得结果可能存在一定局限性，未来应该进一步延长药物干预时间，同时重点研究其分子水平和骨生物力学作用。