赵 琴 黄惠红 汪颖舒 朱广灏 李杰荣 骆前飞 尹一鸣 刘伊晨修彦凤*

（1.上海市奉贤区中医医院， 上海201499； 2.上海中医药大学中药学院， 上海201203）

中药何首乌具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、免疫调节、保肝、益智等多方面的药理作用［1］，其肝毒性问题也有越来越多的报道［1⁃4］。多篇文献报道生何首乌与制何首乌对大鼠肝脏都有不同程度的影响，但制何首乌毒性降低［5⁃7］，长期大剂量灌胃制何首乌才会引起肝损伤，常用剂量对大鼠无毒副作用［8］，不同工艺炮制的何首乌对肝细胞的毒性有所不同［9］，炮制是降低何首乌毒性的有效手段，炮制工艺的差异与其疗效和毒性密切相关。制何首乌炮制方法的研究是解决何首乌毒性的重要方向。

经过查阅文献和调研，发现拌入黑豆汁后蒸制是目前《中国药典》 和各省市的中药炮制规范均收载的方法，但操作方法有所不同，有与黑豆汁拌后蒸至内外均呈棕褐色［10］，无炮制时间的规定；或白天蒸8 h 后晚上闷，第2 天翻动后继续蒸［11］，也有仅蒸制1 d 即停止炮制；或为了提高效率采用高压蒸4 h［12］。在实际生产中，制何首乌的炮制工艺存在着拌入黑豆汁后常压连续蒸制、反复蒸与闷和高压蒸制的不同，不同的黑豆汁蒸制操作方法对制何首乌成分的影响鲜有报道。本实验采用超高压液相四极杆⁃飞行时间质谱 （UPLC⁃Q⁃TOF⁃MS／MS） 对不同操作方法蒸制何首乌的成分整体分析，对结果进行多元变量统计分析，考察不同操作方法得到的制何首乌质量是否存在差异，找出差异显著的成分及其在不同炮制时间过程中的动态变化，以期为规范制何首乌的炮制方法提供参考。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 6530 Accurate⁃Mass Q⁃TOF LC／MS 液质联用系统（美国Agilent 公司）；Sartorius CP225D 型电子分析天平（德国Sartorius 公司）；01J2003⁃04 型立式压力蒸汽灭菌锅（上海东亚压力容器制造有限公司）；SB⁃3200D 超声清洗机（宁波新芝生物科技有限公司）。

1.2 材料 生何首乌 （批号180614⁃1）、黑豆 （批号180614⁃1） 购自上海万仕诚药业有限公司，经上海中医药大学修彦凤副教授鉴定为蓼科植物何首乌Polygonum multi⁃florumThunb.的干燥块根和豆科植物大豆Glycine max（L.）Merr.的干燥成熟种子。乙腈、甲酸为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 黑豆汁制备 按2015 年版《中国药典》 一部制何首乌项下方法［10］，取黑豆10 kg，加水适量，煮约4 h，熬汁约15 kg，药渣再加水煮约3 h，熬汁约10 kg，合并得黑豆汁约25 kg。每100 kg 何首乌片，用黑豆10 kg。

2.2 制何首乌不同炮制品制备

2.2.1 生何首乌 取生何首乌饮片，除去杂质，备用，标记为0 号样品。平行操作得到3 份样品。

2.2.2 连续蒸何首乌 称取9 份生何首乌片，每份300 g，分别加黑豆汁拌匀、润透，置不锈钢蒸锅内，分别蒸制一定时间（8、16、24、32、40、48、56、64、72 h），取出，稍晾，将蒸锅内液体浓缩，拌入何首乌中，干燥，得到9份连续蒸制不同时间的制何首乌，分别标记为1～9 号样品。相同蒸制时间的样品平行制备3 份。

2.2.3 蒸闷何首乌 称取9 份生何首乌片，每份300 g，分别加黑豆汁拌匀、润透，置不锈钢蒸锅内，蒸制加热8 h，闷1 夜，第2 天上下翻动何首乌片，继续蒸制8 h，闷1 夜，如此反复操作，取出，稍晾，将蒸锅内液体浓缩，拌入何首乌中，干燥，得到9 份蒸制不同时间（8、16、24、32、40、48、56、64、72 h） 的制何首乌，分别标记为10～18 号样品。相同蒸制时间的样品平行制备3 份。

2.2.4 高压蒸何首乌 称取9 份生何首乌片，每份300 g，分别加黑豆汁拌匀、润透，置蒸汽灭菌锅内，分别连续蒸制（100 kPa） 一定时间（4、6、8、12、16、20、24、30、36 h），取出，稍晾，将蒸锅内液体浓缩，拌入何首乌中，干燥，得到9 份连续蒸制不同时间的制何首乌，分别标记为19～27 号样品。相同蒸制时间的样品平行制备3 份。

2.3 供试品溶液制备 分别取何首乌不同炮制品（生品、黑豆汁连续蒸品、黑豆汁蒸闷品、黑豆汁高压蒸品） 粉碎，取细粉0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声45 min，放冷，用甲醇补足减失质量，滤过，取续滤液，经0.22 μm 的微孔滤膜过滤，备用。

2.4 分析条件

2.4.1 色谱条件 ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、ACQUITY UPLC BEH C18保护柱（2.1 mm×5 mm，1.7 μm）；流动相0.1% 甲酸乙腈（A） -0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～5 min，5%～32% A；5～6 min，32%～5% A；6～12 min，55%～88% A；12～15 min，88%～90% A；15～17 min，90%～100% A）；柱温35 ℃；体积流量0.3 mL／min；进样量2 μL。

2.4.2 质谱条件 电喷雾离子源（ESI）；负离子扫描模式，质量扫描范围m／z100～1 700；氮气体积流量8 L／min；温度300 ℃；毛细管电压3.5 kV；喷嘴电压1 000 V；碎裂电压150 V，雾化器压力35 psi （1 psi ＝6.895 kPa）；二级质谱碰撞能量15 eV。

2.5 不同何首乌炮制品UPLC⁃QTOF⁃MS／MS 分析 将何首乌不同炮制品的供试品溶液，注入超高压液相色谱仪，进行分析。数据通过Agilent MassHunter Qualitative Analysis B.07.00 数据处理工作站分析，各炮制品在负离子模式下的总离子流图见图1。

图1 何首乌不同炮制品UPLC⁃QTOF⁃MS／MS 总离子流图

图1 表明，何首乌采用不同方法炮制后成分发生了明显变化，成分种类的增加或减少，也有含有量方面的差异。通过进样分析得到的一级质谱，确定了每种成分的相对分子量，根据二级质谱获得裂解信息，结合与对照品的保留时间和质谱信息及文献报道化合物的信息（比较分子离子和／或碎片离子的精确测量分子量和理论值，误差小于10×10-6）［13⁃17］。共鉴定67 种成分，鉴别出43 种成分，另有24种为未知成分，见表1。

表1 何首乌不同炮制品成分鉴定

续表1

续表1

2.6 主成分分析和正交偏最小二乘法⁃判别分析（OPLS⁃DA）

2.6.1 主成分分析 为了进一步观察何首乌炮制前后在总体成分上的差异，采用主成分分析，初步考察黑豆汁拌入后，不同蒸制方法对何首乌的影响，不同炮制品的聚集情况，直观表达出不同蒸制方法对成分的影响是否存在差异。由图2 中各样品的位置可以发现，0 号生何首乌与其他炮制品差异较大；与生何首乌接近的是连续蒸和蒸闷时间最短的8 h 样品1 号和10 号；其他样品随着蒸制时间延长依次距离生品更远，且呈现聚集在一起的趋势。主成分分析表明炮制对何首乌的质量产生了明显的影响，炮制明显改变了何首乌的整体化学成分。制何首乌与生品质量的差异与炮制时间有一定的相关性，随着加工时间的延长，生、制何首乌的成分差异越大。高压蒸制品（19～27 号） 均分布在第一、二象限，距离生品较远，与连续蒸和蒸闷法得到的样品有一定的差异。

图2 何首乌不同炮制品PCA⁃X 图

2.6.2 OPLS⁃DA 根据PCA⁃X 分析结果，以OPLS⁃DA 模式对各个不同炮制品的总离子流中的峰面积进行分析，见图3。同样可以发现，生品与各种炮制品有明显的差异；3种方法所得样品各自聚集在一起，连续蒸制、蒸闷品差异不明显，部分样品有重叠，高压蒸制与另外2 种方法对成分的影响有明显差异。相比较无监督模式的主成分分析，3种方法的样品有更大分离。

图3 何首乌不同炮制品OPLS⁃DA 得分图

2.7 何首乌蒸制过程中部分化学成分动态变化 通过UPLC⁃QTOF⁃MS／MS 分析，可以检测到何首乌中的上千种成分，大部分成分尚未得到鉴定。为了考察拌入黑豆汁后，不同炮制方法、时间对成分的具体影响，以67 种成分的提取离子平均峰面积为指标，采用OPLS⁃DA 模型分析，得到的变量权重值（VIP） ＞1.1 成分有14 种，14 种成分的VIP值大小排序为24＞63＞50＞1＞65＞25＞2＞56＞60＞41＞58＞26＞48＞36。结果见图4。

图4 14 种成分在何首乌不同炮制品中的动态变化趋势

对图4A、4C、4E 中峰面积较高的4 种成分在炮制过程中的变化趋势分析发现，在连续蒸制的过程中，图4A 中成分1、2、24 的峰面积呈现出蒸制8 或16 h 升高后降低，40 h 后含有量趋于稳定，略有下降；成分65 在蒸制24 h 后缓慢升高。图4C 中，4 种成分的变化趋势与连续蒸制法基本一致，不同的是4 种成分的峰面积持续升高的时间延长，蒸闷40～48 h 后降低；由峰面积高度的变化也可以看出4种成分的峰面积明显低于连续蒸制的相应时间样品，可能与连续蒸制有利于成分的持续转化有关。在高压蒸制操作的过程中，图4E 中表现出各种成分的变化趋势明显缓和，趋势与连续蒸制和蒸闷一致，成分1、2、65 整体略高于连续蒸制的样品，成分24 远低于连续蒸制的样品，与相应时间的蒸闷品相近。

对图4B、4D、4F 中10 种成分的变化趋势分析发现，成分25、56、58、60、64 在不同方法所得炮制品中的峰面积均高于生品，成分25、56 的峰面积在3 种方法中均呈现先升高后缓慢降低的趋势，在连续蒸制、蒸闷24～40 h 和高压蒸制8～16 h 后达到最高峰面积后下降；成分58、60、63 的峰面积升高后略有下降，随时间延长基本趋缓，变化不大。其他5 种成分26、36、41、48、50 的峰面积在不同炮制方法样品中表现有所不同，成分26、50 的峰面积在常压连续蒸制、蒸闷后快速降低，而高压蒸制8～12 h 达到最高值后降低，表明该成分的含有量变化与压力有关系；成分48 的峰面积在3 种方法中均呈现蒸制8 h 增加，随着蒸制时间延长，含有量降低；糖苷50 在连续蒸制过程中持续下降，蒸闷8 h 和高压制12 h 后也持续下降，与糖苷在加热过程中的分解有关系；成分36 和41 的峰面积在蒸闷8 h和高压蒸4 h 略有升高后快速降低，连续蒸制样品则随着时间的延长而降低。这10 种成分在连续蒸制和蒸闷法炮制的对应时间样品中差别不明显；与连续蒸制和蒸闷法所得样品相比，高压蒸制品中成分25、26、48、56、63 的峰面积增高，成分58 的峰面积则明显降低，表明高压蒸制较常压蒸制对部分成分的转化或溶出的影响更大。

3 讨论

针对目前市场流通的制何首乌主要是采用拌入黑豆汁后蒸制，但操作方法和炮制时间不一的现状，对采用连续蒸制、蒸闷交叉进行、高压蒸制法炮制所得制何首乌中成分进行了整体分析，同时模仿“九蒸九晒” 的时间概念，每种操作方法制备9 个不同时间点样品。采用UPLC⁃Q⁃TOF⁃MS／MS 分析鉴别出43 种成分，另有24 种未知成分，鉴别出的成分涵盖了何首乌中的主要有效成分蒽醌类、二苯乙烯苷类、多酚类等。

采用主成分分析和OPLS⁃DA 分析了制何首乌的整体成分，何首乌经过蒸制后发生了明显差异，可能与蒸制过程中发生的水解、脱水、异构化和美拉德反应有关［13］；连续蒸制和蒸闷样品相近，具有一定相似度，高压制品则存在明显差异，推测是其成分在常压和高压的条件下发生了程度不同的转化。不同的操作方法会对各种成分产生一定的影响，炮制程度是否适宜直接影响何首乌的临床疗效。