李 喆 刘博男 张 超 华 悦 史 辑

（1.辽宁中医药大学药学院， 辽宁大连116600； 2.国家中医药管理局炮制原理解析重点实验室， 辽宁大连116600； 3.辽宁省中药炮制工程技术研究中心， 辽宁大连116600）

酸枣仁为鼠李科植物酸枣Ziziphus jujubaMillvar.spinosa （Bunge） Huex H.F chou 的干燥成熟种子。最早记载于《本草经集注》，被誉为养心安神之上品中药，具有养心补肝、宁心安神、敛汗生津的功效［1⁃2］。酸枣仁主要含有皂苷、黄酮、生物碱、脂肪酸等成分，其中黄酮和皂苷类为治疗失眠的主要活性物质［3⁃5］。酸枣仁传统的炮制方法为清炒法［6］，《证类本草》［7］中记载，“睡多生使，不得睡炒熟”。《本草蒙筌》［8］中亦有云，“能治多眠不眠，必分生用炒用。多眠胆实有热，生研末；不眠胆虚有寒，炒作散”。现代研究表明酸枣仁生品和炮制品均具有镇静安神作用，以炒酸枣仁的作用更强［9］。《本草求真》［10］中记载，“酸枣仁炒久油枯不香，碎则气味俱失，便难见功”，可见炒制火侯对酸枣仁的功效发挥影响很大。

目前炒制酸枣仁缺乏具体的工艺参数，难以控制饮片质量，影响临床用药的有效性。本实验通过正交试验，结合具有系统、灵活、简洁的层次分析法，优化炒制酸枣仁的炮制工艺参数。酸枣仁皂苷类主要为五环三萜类和四环三萜类结构型皂苷，黄酮类主要为碳苷类，均为酸枣仁中镇静安神、抗抑郁、抗焦虑等药效物质基础［11⁃13］。本实验以酸枣仁中的斯皮诺素、6‴⁃阿魏酰斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、白桦脂酸为指标，采用正交设计结合层次分析法对酸枣仁的炒制工艺进行优化，以期为工业大生产提供数据支持，为炮制原理解析提供依据。

1 材料

1.1 仪器 Waters e2695⁃2424 型高效液相色谱仪、蒸发光检测器（美国Water 公司）；KQ⁃250E 型医用超声波清洗器 （江苏昆山市超声仪器有限公司）；AE240 型电子分析天平（十万分之一，瑞士梅特勒⁃托利多公司）；RE⁃52C 旋转蒸发仪、Milli⁃Q净水仪（法国Milipore 公司）；燃气灶（美的有限公司）。

1.2 材料 酸枣仁药材收集于辽宁、河北、山东等省，经辽宁中医药大学翟延君教授鉴定为鼠李科植物酸枣Ziziphus jujubaMillvar.spinosa （Bunge）Huex H.F chou 的干燥成熟种子。对照品斯皮诺素（批号N0604AS，纯度＞98%）、酸枣仁皂苷A （批号A0703AS，纯度＞98%）、6‴⁃阿魏酰斯皮诺素（批号N0605AS，纯度＞98%）、白桦脂酸（批号O0930AS，纯度＞98%） 均购于大连美仑生物技术有限公司。甲醇为色谱纯，石油醚（60～90 ℃）、乙醇为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 指标成分测定

2.1.1 对照品溶液制备 分别精密称取斯皮诺素、6‴⁃阿魏酰斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、白桦脂酸对照品适量，加甲醇溶液定容于10 mL 量瓶中，摇匀，即得对照品母液。分别吸取该对照品母液各2 mL于10 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得含斯皮诺素0.274 mg／mL、6‴⁃阿魏酰斯皮诺素0.272 mg／mL、酸枣仁皂苷A 0.150 mg／mL、白桦脂酸0.292 mg／mL 的混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液制备 取酸枣仁饮片粉末，过4 号筛，精密称定1 g，置索氏提取器中，加入石油醚（60～90 ℃） 100 mL，加热回流4 h，弃去石油醚液，药渣挥去溶剂，加入70%乙醇20 mL，加热回流2 h，滤过，滤渣用5 mL 70%乙醇洗涤，合并洗液与滤液，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 色谱条件 Ecosil 120⁃5⁃C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）；流动相乙腈（A） ⁃水（B），梯度洗脱 （0～12 min，20%～40% A；12～17 min，40% A；17～19 min，40%～95% A；19～30 min，95% A）；体积流量1 mL／min；柱温35 ℃；气体压力40 psi （1 psi ＝6.895 kPa）；漂移管温度65 ℃［12］。色谱图见图1。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.1.4 线性关系考察 取各个对照品溶液分别稀释成一系列不同质量浓度的对照品溶液，在“2.1.3” 项色谱条件下进样，以峰面积的对数为纵坐标（Y），以进样量的对数为横坐标（X），进行回归结果见表1。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.1.5 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液，在“2.1.3” 项色谱条件下，连续进样6 次，测定峰面积。测得斯皮诺素、6‴⁃阿魏酰斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、白桦脂酸峰面积RSD 分别为1.36%、2.37%、1.99%、0.38%。表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，在“2.1.3” 项色谱条件下，分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h 进样，测得斯皮诺素、6‴⁃阿魏酰斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、白桦脂酸峰面积RSD分别为1.56%、1.99%、1.21%、0.21%。表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.1.7 重复性试验 取同一批次6 份酸枣仁样品，每份1 g，精密称定，按“2.1.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1.3” 项色谱条件下进样。测得斯皮诺素、6‴⁃阿魏酰斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、白桦脂酸峰面积RSD 分别为2.29%、2.63%、1.50%、0.26%。表明该方法重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验 精密称定已知含有量的酸枣仁饮片粉末6 份，每份1 g，按照比例对照品加入量⁃样品中含有量约（1 ∶1） 加入对照品，按“2.1.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1.3”项色谱条件下进行测定，结果见表2。

表2 各成分加样回收率试验结果（n＝6）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents （n＝6）

2.2 炮制工艺优化

2.2.1 多指标综合加权评分法 根据层次分析法（AHP） 的原理［14⁃15］，利用yaahp v10.3 应用软件，将综合OD值设为决策目标，将斯皮诺素、6‴⁃阿魏酰斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、白桦脂酸的权重系数设为方案层，建立判断矩阵，判断矩阵一致性比率（CR） ＜0.1，表明判断矩阵一致性较好，求得的权重系数合理有效，无逻辑混乱，结果见表3。分别给予斯皮诺素0.341 6、6‴⁃阿魏酰斯皮诺素0.106 9、酸枣仁皂苷A 0.383 2、白桦脂酸0.168 2的权重系数，加权综合评分，计算综合OD值。

表3 工艺指标准则层判断矩阵Tab.3 Criterion layer judgment matrix on process indicators

2.2.2 不同炮制工艺对比 分别将酸枣仁以烘箱105 ℃加热3 min，微波800 W 加热2 min，空气炸锅150 ℃加热3 min 和130～140 ℃清炒1 min 进行炮制，按“2.1.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1.3” 项色谱条件下进样，测得斯皮诺素、6‴⁃阿魏酰斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、白桦脂酸的含有量，计算OD值，清炒法OD值最高。因此选择清炒法作为进一步考察的炮制工艺。结果见表4。

2.2.3 单因素考察 取酸枣仁饮片8 份，每份100 g，分别在100～110、110～120、120～130、130～140、140～150、150～160、160～170 ℃下炒制3 min，重复3 次，取平均值，测得斯皮诺素、6‴⁃阿魏酰斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、白桦脂酸的含有量，对不同炒制温度进行评价，结果见图2，表明炒制温度140～150 ℃时OD值最高。

取酸枣仁饮片8 份，每份100 g，分别在140～150 ℃下炒制1、2、3、4、5、6、7、8 min，重复3 次，取平均值，测得4 种成分的含有量，对不同炒制时间进行评价，结果见图3，炒制时间1 min时OD值最高。

图2 不同炒制温度对OD 值的影响Fig.2 Effect of different cooking temperatures on OD values

2.2.4 正交试验设计 通过对炒制温度（A）、炒制时间（B） 进行单因素考察，确定设计因素范围为炒制温度130～160 ℃，炒制时间30～90 s；采用正交设计软件进行最优设计，每因素设置3 个水平，采用L9（34） 正交表设计试验，见表5。

图3 不同炒制时间对OD 值的影响Fig.3 Effect of different cooking times on OD values

表5 因素水平Tab.5 Factors and levels

2.2.5 正交试验结果 分别取同一批酸枣仁饮片各100 g，按表5 中实验设计进行炮制。在“2.1.3” 项色谱条件下测定4 种成分的含有量。结果见表6。

2.2.6 结果分析 方差分析结果见表7。影响酸枣仁炒制的因素为炒制温度 （A） 和炒制时间（B），炒制时间具有显著性差异。酸枣仁炒制的最佳工艺为A1B2，即炒制温度130～140 ℃，炒制时间60 s。

表6 试验设计与结果Tab.6 Design and results of tests

表7 方差分析Tab.7 Analysis of variance

2.2.7 验证试验 按“2.2.6” 项下最佳工艺进行3 次验证试验，按“2.1.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1.3” 项条件下测定4 种成分的含有量，计算综合OD值，结果见表8。由验证试验结果可知，综合评分RSD 为2.98%。表明此方法稳定，可靠，合理，可行。

表8 验证试验结果Tab.8 Results of validation tests

2.3 不同产地酸枣仁炒制前后化学成分的含有量比较 收集了10 批不同来源的酸枣仁，按“2.2.6” 项下工艺进行炒制，按“2.1.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1.3” 项色谱条件下进行测定，结果见表9。

结果表明，酸枣仁经炒制后斯皮诺素、6‴⁃阿魏酰斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、白桦脂酸的含有量均有不同程度的升高。

3 讨论

2015 年版《中国药典》 中酸枣仁的含有量测定指标成分为斯皮诺素和酸枣仁皂苷A，且二者测定方法不同，不能同时测定。本实验采用HPLC⁃ELSD 法，优化色谱条件，能同时测定斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、6‴⁃阿魏酰斯皮诺素、白桦脂酸的含有量。酸枣仁炒制后，镇静催眠作用增强。对10 批不同产地酸枣仁炒制前后的化学成分分析显示，酸枣仁皂苷A、斯皮诺素、6‴⁃阿魏酰斯皮诺素、白桦脂酸的含有量均有所增加，可能由于酸枣仁的炒制时间比较短，炒制温度适中（文火），没有造成皂苷、碳苷类成分的降解，而炒制过程中的迅速翻炒会促使酸枣仁中的水分损失，使组织结构变得疏松，利于有效成分的溶出，这也是药效活性提高的物质基础所在。

本实验采用了层次分析法［16］，建立判断矩阵，可以将人们的主观思维严谨化，将各个指标给予相应的权重系数，进而结合加权评分优化出酸枣仁炒制的最佳工艺，使其更具逻辑性和科学性。

本实验通过单因素试验分别选取了炒制温度和炒制时间的最优值，并在此基础上设计正交试验，最终优化出炒制酸枣仁的最佳工艺。由于炒制期间温度较难固定在一个指定值，故本实验温度因素选取了一个区间值，且火力为文火，实时温度计测定锅中温度，能够较好的控制温度在130～140 ℃之间，确保饮片质量尽可能稳定。

目前文献报道酸枣仁的新型炮制方法有微波炮制、蜜炙等［17⁃18］，其加热原理各不相同。然而清炒酸枣仁是最传统且最常用的炮制方法，同时更适合工业大生产。根据实验前期对不同炮制方法的比较以及最后得出的最佳炮制工艺可以看出，炮制温度和炮制时间与酸枣仁饮片质量紧密相关，且酸枣仁不宜炮制时间过长，进而证实古籍中酸枣仁“久炒则油枯不香” 的论述。因此确定酸枣仁的最优炮制条件，便能极大程度提高酸枣仁的饮片质量。