侯丽媛，董艳辉，聂园军，邓 舒，肖 蓉，张春芬，李亚莉，赵 菁，王育川，曹秋芬

（1.山西农业大学生命科学学院，山西太原030031；2.山西农业大学农业经济管理学院（山西省农业科学院农业资源与经济研究所），山西太原030006；3.山西农业大学果树研究所，山西太原030031）

苹果是世界上最重要的果树之一。对苹果种质资源的准确鉴定是苹果种质资源保存和利用的前提。苹果种质资源的鉴定方法有多种，如形态学观察、同工酶[1-2]以及分子标记[3-5]等。而SSR分子标记即简单重复序列（SSR），又称微卫星标记，是普遍存在且随机分布于真核生物基因组中的一种特殊序列，SSR标记具有共显性、丰富的多态性、高度重复性、高度可靠性以及操作简单等优点，是近年来应用广泛的一类特异性强的分子标记。

TP-M13-SSR（Simple sequence repeat with tailed primer M13）技术是荧光测序技术和SSR技术相结合形成的一种对扩增产物进行荧光检测的体系[6]，该技术具有结果重复性高、准确性好的特点，并在较大程度上解决了扩增产物检测流程繁琐、分析通量较低、记录数据工作量过大等一系列问题[7]。目前，TP-M13-SSR技术已经被应用到许多作物的种质资源研究中。张志军等[8]利用TP-M13-SSR标记技术对23个麦芽品种进行了指纹图谱构建。樊云芳等[9]运用TP-M13-SSR技术对29份枸杞种质资源进行了遗传多样性分析。BARKLEY等[10]对花生的遗传多样性进行了评价。有关果树方面，高源等[11]构建了我国原产苹果属27份材料在12个SSR位点的指纹图谱；CAO等[12]对我国72份野生山梨进行了遗传多样性分析。

本研究利用16对TP-M13-SSR标记对山荆子和24份我国华北地区部分苹果栽培品种的指纹图谱进行构建，并在此基础上对试验材料进行亲缘关系和遗传多样性分析，旨在为后期更有效地利用这些苹果种质资源进行研究提供重要依据。

1 材料和方法

1.1 材料

选取目前我国华北地区部分苹果属25份材料，其中，苹果系材料24份，砧木系材料1份（表1），25份材料均取自国家果树种质兴城苹果资源圃（中国农业科学院果树研究所）。

1.2 试验方法及数据处理

1.2.1 试验方法 采用德国QIAGEN的DNeasy Plant Mini Kit试剂盒分别提取各供试材料春季嫩叶基因组DNA。选取245对扩增片段长度在100～300 bp的普通SSR序列，参照YAMAMOTO等[13]、GIANFRANCESCHIÁ等[14]、LIEBHARD等[15]和高源等[16]的研究，共合成16对TP-M13-SSR引物。TPM13-SSR引物是由3条引物组成，其中，第1条引物是普通SSR引物的正向引物；第2条引物由带有M13接头的正向引物和普通SSR引物的反向引物相连而成；第3条引物是5′端带有荧光标记的M13正向引物。上海Sangon公司合成第1、2条引物；美国ABI公司合成第3条引物，5′端带有荧光标记的M13正向引物标记的3种荧光分别为6FAMTM（Blue）、VICTM（Green）和NEDTM（Yellow）（表2）。

表2第3条引物及序列

1.2.2 PCR扩增和纯化体系16对TP-M13-SSR 引物的名称、序列及优化退火温度如表3所示。

表3 16对TP-M13-SSR引物序列及其优化条件

1.2.2.1 试验程序[5，11-12]因TP-M13-SSR引物的2条序列之间存在19 bp的差别，因此，TP-M13-SSR引物的PCR反应需要分2步进行，第1步需要获得TP-M13-SSR引物的扩增产物；第2步是实现SSR扩增产物的荧光标记，即5′端带有荧光标记的M13正向引物的扩增。

TP-M13-SSR引物PCR反应体系为：DNA（20 mg/L）2μL，F-primer（2μmol/L）0.12μL，Rprimer（2μmol/L）1.2μL，10×PCR buffer（不含Mg2+）1μL，Mg2+（25 mmol/L）0.8μL，dNTP（25 mmol/L）0.1μL，Taq酶（5 U/μL）0.12μL，ddH2O补足10μL。PCR反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性45 s，退火（根据不同引物选择不同的退火温度）45 s，72℃延伸45 s，35个循环；72℃保持10 min。4℃保存备用。

以TP-M13-SSR引物PCR产物为模板，加入5′端带有荧光标记的M13正向引物（2μmol/L）1.8μL，10×PCR buffer（不含Mg2+）0.1μL，Taq酶（5 U/μL）0.08μL，ddH2O 0.12μL。PCR反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸30 s，16个循环；72℃保持10 min。4℃保存备用。1.2.2.2 PCR产物的纯化 根据荧光标记引物的不同颜色以及扩增产物分子量的大小进行混合纯化。取2μLPCR产物，在其中加入无水乙醇6μL，轻轻振荡2～3 min混匀，然后3 000 r/min离心30 min；轻轻倒出液体，倒置离心管片刻后于700 r/min离心30～60 s，甩干液体；加入70% 乙醇60μL，轻轻振荡2～3 min，3 000 r/min离心10 min；轻轻倒出液体，倒置离心管片刻后于700 r/min离心30～60 s，静置5 min；加入60μL ddH2O，振荡混匀，室温避光溶解1 h。4℃保存备用。

用测序仪ABI3730对纯化的TP-M13-SSR引物的PCR产物进行自动荧光检测，并对获得的不同样品在每个TP-M13-SSR位点的扩增片段长度进行收集。

1.2.3 数据处理 将收集到的原始数据转换成以1和0标记的数据值矩阵，采用NTSYS-pc 2.10e分析软件，用Jaccard相似系数进行计算，得到相似系数矩阵。在此基础上，采用UPGMA（Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic Mean）方法对试验材料进行聚类分析，得到这些材料的亲缘关系树状图。最后利用GenAlEx 6.501软件对供试材料进行遗传多样性分析。

2 结果与分析

2.1 25份试材的指纹图谱分析

利用16对TP-M13-SSR引物对25份苹果属材料进行PCR检测，准确获得了不同材料在16个TP-M13-SSR位点的指纹信息（表4）。以种植面积相对较大的苹果品种最良富士为例进行指纹图谱分析。最良富士在4对TP-M13-SSR引物位点的毛细管电泳图谱如图1所示，在每个TP-M13-SSR位点获得的等位基因数即为表4中最良富士在该位点对应的扩增片段的长度。

每对TP-M13-SSR引物的扩增带型为3～13个，平均为8.716个。25份苹果属供试材料在16对TP-M13-SSR引物位点获得的指纹数据互不相同，该指纹数据即为各供试材料的指纹图谱，这些指纹图谱也是各品种的特定谱带，该谱带可以作为鉴定各品种的依据。

表4 25份苹果属种质资源在16对TP-M13-SSR引物位点的指纹图谱

2.2 扩增产物的多态性分析

表5 25个苹果属种质在16对TP-M13-SSR引物位点检测到的的遗传多样性

由表5可知，供试的25份苹果属种质在16对TP-M13-SSR引物中共扩增出等位基因180个，平均每对TP-M13-SSR引物观测到的等位基因数为11.25个，有效等位基因数为5.38个；不同供试材料在每个TP-M13-SSR位点检测到的等位基因数不同，3～21个不等，其中，在SSR位点BGT23b和KA4b检测到等位基因数为3个，在SSR位点CH01f07a检测到等位基因数为21个。扩增片段长度大小范围主要在104～245 bp，其中，SSR引物CH04h02的扩增片段大小范围最大，为155～245 bp，相差90 bp；引物KA4b扩增片段大小范围最小，为155～159 bp，相差4 bp。Shannon's指数从BGT23b的0.265到CH01f07a的2.670，平均为1.827。等位基因数和Shannon's指数均高于平均值的SSR引物有CH03d07、CH04e03、CH04h02、CH05c06、CH05d08、CH01f07a、CH04g07、CH05h12。观测杂合度为0.040（BGT23b）～0.096（CH04g07），平均为0.741；期望杂合度值从BGT23b的0.114到CH01f07a的0.907，平均为0.742；无偏杂合度期望值从BGT23b的0.117到CH01f07a的0.926，平均为0.758。固定指数平均为0.036，说明供试苹果品种间含有的纯合子较多。

2.3 亲缘关系分析

根据16对TP-M13-SSR引物的扩增数据，采用NTSYSpc 2.10e软件计算不同种质之间的相似系数，结果表明（表6），25份苹果属材料的相似系数在0.72～0.94，平均达到0.83，说明在分子水平上各材料间的遗传亲缘关系较近。

25 1.00 24 1.00 0.79 23 1.00 0.81 0.79 22 1.00 0.78 0.78 0.80 21 1.00 0.76 0.88 0.81 0.75 20 1.00 0.73 0.71 0.73 0.71 0.71 19 1.00 0.71 0.80 0.76 0.80 0.81 0.80 18 1.00 0.81 0.72 0.79 0.81 0.83 0.85 0.83 17 1.00 0.83 0.81 0.73 0.82 0.82 0.83 0.81 0.81 16 1.00 0.82 0.87 0.78 0.73 0.83 0.81 0.81 0.85 0.80数系似15 1.00 14 1.00 0.93 0.80 0.79 0.83 0.81 0.82 0.83 0.83 0.79 0.76 0.72 0.82 0.81 0.80 0.79 0.88 0.86 0.81 0.81 0.81 0.79相源资13 1.00 0.84 0.86 0.77 0.81 0.75 0.78 0.73 0.81 0.75 0.83 0.76 0.78质种属12 1.00 0.80 0.79 0.81 0.81 0.86 0.78 0.77 0.71 0.82 0.78 0.81 0.78 0.79果苹份25 6 11 1.00 10 1.00 0.82 0.85 0.83 0.81 0.81 0.80 0.82 0.81 0.85 0.85 0.81 0.83 0.91 0.81 0.85 0.78 0.83 0.73 0.74 0.93 0.83 0.78 0.77 0.86 0.87 0.83 0.82 0.78 0.78表9 1.00 0.77 0.73 0.73 0.76 0.75 0.78 0.76 0.74 0.74 0.78 0.71 0.74 0.72 0.76 0.71 0.79 8 1.00 0.73 0.81 0.79 0.77 0.73 0.80 0.80 0.85 0.81 0.92 0.78 0.71 0.77 0.78 0.79 0.83 0.79 7 1.00 0.77 0.76 0.81 0.80 0.78 0.82 0.84 0.86 0.83 0.80 0.79 0.80 0.74 0.78 0.81 0.81 0.80 0.83 6 1.00 0.78 0.80 0.76 0.82 0.80 0.78 0.76 0.80 0.83 0.79 0.83 0.81 0.82 0.72 0.81 0.81 0.82 0.78 0.77 5 1.00 0.83 0.82 0.81 0.75 0.88 0.83 0.85 0.80 0.80 0.82 0.82 0.94 0.82 0.81 0.73 0.82 0.80 0.82 0.80 0.80 4 1.00 0.87 0.83 0.80 0.76 0.76 0.85 0.81 0.82 0.79 0.75 0.79 0.78 0.87 0.78 0.80 0.73 0.82 0.76 0.83 0.75 0.80 3 2 1.00 1.00 0.81 0.82 0.81 0.81 0.85 0.83 0.82 0.85 0.82 0.78 0.78 0.76 0.77 0.83 0.83 0.80 0.78 0.78 0.81 0.80 0.78 0.83 0.80 0.86 0.81 0.80 0.78 0.81 0.85 0.80 0.81 0.84 0.83 0.72 0.71 0.80 0.79 0.76 0.75 0.83 0.82 0.82 0.80 0.76 0.84 1 1.00 0.80 0.84 0.78 0.80 0.82 0.83 0.80 0.79 0.83 0.79 0.77 0.82 0.88 0.88 0.78 0.80 0.82 0.81 0.72 0.82 0.78 0.83 0.78 0.77号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25编

在相似系数0.72处，25份苹果属种质资源可以明显分为2个类群，即山荆子组（Ⅰ）和苹果组（Ⅱ），其中，山荆子组（Ⅰ），只有山荆子（20）1个种质，苹果组（Ⅱ）包括其他24份苹果栽培材料；在相似系数0.82处，苹果组（II）又被分为8组（Ⅱ-1～II-8），其中，Ⅱ-1组中只有舞美（9）1个品种，Ⅱ-2组中也只有蜜脆（22）1个品种，Ⅱ-3组中有红星（8）、元帅（18）、祝光（16）和青香蕉（24）；Ⅱ-4组中是初秋（2）和旭（25）；Ⅱ-5组中新嘎拉（6）和王林（19）聚在了一起；Ⅱ-6组有红玉（11）、锦玉（21）和中秋（23）；Ⅱ-7组中有金冠（5）、金矮生（17）、津轻（4）、丹霞（10）和乔纳金（12）；Ⅱ-8组中最良富士（1）、长富1号（14）、长富2号（15）、千秋（3）、国光（7）和寒富（13）聚在一起（图2）。

3 讨论

3.1 SSR引物的特点

SSR分子标记因其特性近年来得到了广泛应用[17]。TP-M13-SSR技术是基于SSR分子标记技术发展起来的一种对扩增产物进行荧光检测的体系，其实现了对SSR分子标记数据的准确和高效的收集，对仅有2 bp之差的差异片段能够进行有效区别，非常适用苹果种质资源指纹图谱的构建[18-19]。本研究选用的16对TP-M13-SSR引物多态性较好，杂合度较高，在16对SSR引物位点获得的指纹图谱互不相同，可以作为各品种的特定谱带，适宜构建苹果品种SSR指纹图谱及进行遗传多样性分析。

3.2 遗传多样性分析

观测等位基因数越高则表明SSR位点的多态性和群体变异程度越高[20]。本研究对供试的25份苹果属种质在16对TP-M13-SSR引物位点进行扩增，共检测到180个等位基因位点，平均每对引物观测到的等位基因数为11.25个；每个TP-M13-SSR位点可检测到的等位基因数为3～21个不等，大小范围主要在104～245 bp，其中，在SSR位点BGT23b和KA4b检测到等位基因数为3个，在SSR位点CH01f07a检测到等位基因数为21个，扩增片段大小范围主要在170～232 bp，SSR引物CH04h02的扩增片段大小范围最大，为155～245 bp，相差90 bp；引物KA4b扩增片段大小范围最小，为155～159 bp，相差4 bp。

平均有效等位基因数、平均Shannon信息指数、平均期望杂合度等是用来评价遗传多样性的常用指标。16对引物的平均有效等位基因数为5.38个，Shannon's指数从BGT23b的0.265到CH01f07a的2.670，平均为1.827，等位基因数和Shannon's指数均高于平均值的SSR引物有CH03d07、CH04e03、CH04h02、CH05c06、CH05d08、CH01f07a、CH04g07、CH05h12。观测杂合度从BGT23b的0.040到CH04g07的0.096，平均为0.741；期望杂合度值从BGT23b的0.114到CH01f07a的0.907，平 均 为0.742；无偏杂合度期望值从BGT23b的0.117到CH01f07a的0.926，平均为0.758。

固定指数是群体中杂合子频率差异的估计值，是通过杂合子频率偏差来反映群体在某个座位的遗传分化程度[21]。本研究中，固定指数在7对SSR引物位点为正值，平均为0.036，接近于0，说明供试苹果品种间含有的纯合子存在过量现象但是过量不明显，也说明供试材料接近于Hardy-Weinberg平衡。鉴于此，在育种工作中要尽量扩大选择范围，引入新的种质，促使种群间的基因交流和重组，以提高后代的品质。

3.3 聚类分析

本研究根据16对TP-M13-SSR引物对供试的25份苹果属种质材料的扩增数据计算相似系数，并进行遗传分析和聚类分析，结果显示，25份材料的相似系数在0.72～0.94，平均达到0.83，说明在分子水平上各材料间的遗传亲缘关系较近。在相似系数0.72处，25份苹果属种质资源可以明显分为2个类群，即山荆子组（I）和苹果组（II），其中，山荆子组（I）只有山荆子（20）1个种质，苹果组（II）包括其他24份苹果栽培材料。种质间相似系数较低说明遗传关系相对较远，而相似系数较高则说明种质间具有相近的亲本起源。本研究结果显示，山荆子和其他苹果栽培品种间遗传相似系数相对较低，二者间亲缘关系相对较远，仅从遗传相似系数的数值来说，山荆子和苹果栽培品种间的遗传分化不是太大。山荆子属蔷薇科苹果属，与苹果嫁接后亲和力强，是我国北方苹果繁殖的主要砧木材料。本研究对山荆子作为苹果常用砧木进行了分子水平的解释。

在相似系数0.82处，苹果组（II）又被分为8组（II-1～II-8），其中，II-1组中只有舞美（9）1个品种，舞美是英国东茂林试验站从威赛克旭自然实生苗中选育的柱型苹果，与其他栽培种苹果亲缘关系相对较远；II-2组中也只有蜜脆（22）1个品种，蜜脆由Macoun×Honeygold杂交选育而来，原产于美国，说明蜜脆与其他苹果品种之间遗传关系相对较远；II-3组中有红星（8）、元帅（18）、祝光（16）和青香蕉（24），其中，红星苹果为元帅的芽变品种，祝光原产于美国，由实生选种而来，青香蕉由实生选种而来，说明这4个早期的苹果实生品种的来源很相近，红星（8）和元帅（18）在相似系数0.92处聚为一类，亲缘关系较近，但与祝光（16）和青香蕉（24）亲缘关系较远；II-4组中有初秋（2）和旭（25），初秋是从红玉和金冠的杂交种中选育而来，原产于日本，旭原产于加拿大，为实生选种，说明二者遗传距离相对较近，初秋的亲本红玉和金冠与旭亲缘关系较近；II-5组中新嘎拉（6）和王林（23）聚在了一起，新嘎拉是嘎拉（（元帅×桔苹）×金冠）的枝变，王林是由金冠×印度杂交选育而来，这2个品种更多地保留了金冠的遗传特性；II-6组有红玉（11）、锦玉（21）和中秋（23），其中，红玉为可口香的实生后代，原产于美国，锦玉是红玉的芽变，二者间遗传距离较近，中秋是红玉和元帅的杂交种，其更多保留了红玉的遗传特性；II-7组中有金冠（5）、金矮生（17）、津轻（4）、丹霞（10）和乔纳金（12），其中，金矮生是金冠的短枝芽变，二者相似系数为0.94，亲缘关系很近，津轻的母本为金冠，丹霞是由金冠实生苗选育而来，乔纳金是金帅（金冠）×红玉杂交种，说明津轻、丹霞和乔纳金从遗传学角度来说更多地保留了金冠的遗传特性；II-8组中最良富士（1）、长富1号（14）、长富2号（15）、千秋（3）、国光（7）和寒富（13）聚在一起，其中，最良富士、长富1号、长富2号和寒富都为富士系，是富士芽变，国光为富士（国光×元帅）的亲本，富士为千秋（东光×富士）的亲本，这些品种都含有国光的血缘，表明从遗传学上来讲，富士及其后代保留了母本国光更多的遗传特性。

4 结论

本研究结果显示，TP-M13-SSR分子标记的分析结果与已知苹果属间的谱系较为一致，聚类分析结果能完全体现后代与亲本之间的亲缘关系，另外，从分子水平对山荆子作为苹果常用砧木也进行了验证。