李梦雨，张在宝，戚 继，常 芳

(复旦大学 生命科学学院 植物科学研究所，上海 200438)

作为开花植物的雄性生殖器官，雄蕊的正常发育是植物进行有性生殖的必要条件，对植物繁衍后代和农业生产都有着非常重要的作用.研究植物雄蕊发育的信号网络有助于揭示有性生殖的调节机制，为提高农作物产量提供必要的科学依据.

根据形态变化和发生的主要事件，模式植物拟南芥的花药发育过程共分为14个时期[1-2].花药发育第1期，花药原基出现，产生L1、L2、L3 3个细胞层；第2期，L2层细胞中有4个分化为孢原细胞；第3期，孢原细胞垂周分裂形成初级周缘细胞和初级造孢细胞；第4期，初级周缘细胞垂周分裂形成两层次级周缘细胞；第5期，L1层细胞不断平周分裂形成花药各药室的表皮层，外层的次级周缘细胞形成药室内皮层，内层的次级周缘细胞形成绒毡层和中间层，而初级造孢细胞则分裂分化形成小孢子母细胞(花粉母细胞).至此，花药的形态建成初步完成，形成由4个药室规则排列组成的蝴蝶状结构，且每个药室是由自外而内的表皮层、内皮层、中间层、绒毡层、花粉母细胞5层细胞组成的典型结构[1-3].之后，在第6～8期，花粉母细胞经历减数分裂形成四分体，包被四分体的胼胝质降解释放出小孢子.随后，小孢子进一步经过有丝分裂及花粉壁发育过程，并在第13期，发育为成熟花粉粒，经由花药壁开裂而释放出来.最后，雄蕊逐渐老化脱落[4].

近几十年，借助于反向遗传学的突变体鉴定和功能分析，揭示了一系列基因在花药发育过程中的功能.特别是转录因子SPL(Sporocyteless/Nozzle)[5-6]及受体蛋白激酶BAM1(Barely Any Meristem 1)和BAM2(Barely Any Meristem 2)[7-8]在调控花药早期发育的过程中发挥重要作用.

SPL编码MADS-box转录因子，调控孢原细胞的分裂分化.SPL基因在花药发育第2～3期开始在造孢细胞中表达，但在第4期前表达都较弱，直至第5期在花粉母细胞中强烈表达，而在周缘细胞中并未观察到SPL表达，表明SPL更倾向于在造孢细胞中发挥作用[5-6].spl突变体中，孢原细胞在花药发育第3期分裂为初级周缘细胞和初级造孢细胞，初级周缘细胞在花药发育第4期分裂形成两层次级周缘细胞，这与野生型中的过程相同.但之后，两层次级周缘细胞无法进一步分裂分化，同时初级造孢细胞开始液泡化、不能产生花粉母细胞.最终，突变体花药各层细胞异化为高度液泡化的薄壁细胞，不能产生花粉母细胞及形态正常的花药结构，从而导致植株败育.

BAM1和BAM2编码富含亮氨酸重复受体样蛋白激酶(LRR-RLKs)，两者蛋白相似度超过85%[7].BAM1/2最早在花药第2期的孢原细胞中表达，之后则在造孢细胞和小孢子母细胞中表达更多.bam1和bam2单突变体花药无明显发育缺陷，而bam1bam2双突变体花药的内皮层、中层和绒毡层细胞不能正常形成，而是被类似小孢子母细胞的细胞群所代替，这些细胞群会在减数分裂前降解退化，最终不产生可育花粉粒，造成雄性不育，表明BAM1和BAM2之间存在功能冗余[8].

因SPL和BAM1/2最早均在花药发育第2期表达，并且spl突变体的花药表型缺陷比bam1bam2更为严重，故本文认为SPL位于BAM1和BAM2的上游，调控BAM1和BAM2的功能.有趣的是，BAM1在spl突变体花药中表达范围缩小，被限制在表皮细胞附近；而SPL在bam1bam2突变体花药中的表达范围增大，由原来只在孢原细胞表达扩大为在几乎所有的L2层细胞中都有表达.SPL与BAM1/2在彼此突变体中表达水平和表达范围的变化，暗示SPL可能在某些区域正向调控促进BAM1的表达，而BAM1/2则反过来在某些区域对SPL的表达发挥抑制作用，推测两者之间可能存在负反馈调节环路[3,8].当然，这种推测尚缺乏深入证据.

此外，从表型上来看，spl突变体不形成花粉母细胞，而bam1bam2双突变体花药则形成过多类似花粉母细胞的细胞，也暗示两者在一定程度上可能存在不同功能.那么，两者通过反馈调节环路调控了哪些下游基因的表达，又在调控花药发育过程中发挥哪些各自特异的功能呢？相信通过高覆盖度的转录组为代表的分子表型分析，会给我们一个答案.

因此，本论文中，我们分别获得了spl，bam1，bam2，bam1bam2相比于野生型(WT)的转录组测序数据，通过深入对比分析，明确了BAM1和BAM2两个同源基因的功能冗余和分化，并揭示了SPL和BAM1/2共同调控的下游基因网络，以及两者间的功能差异.

1 材料和方法

1.1 材料

本文转录组数据来源于拟南芥Ler、Col-0、spl、bam1-3、bam2-3、bam1bam2植株的4～6期花药.其中，spl和bam2-3突变体为兰兹贝格生态型(Ler)，bam1-3突变体本为哥伦比亚生态型(Col-0)，但取材自bam1-3和Ler野生型进行6次以上回交后的纯合植株[8]，bam1bam2突变体由bam1-3突变体和bam2-3突变体杂交而成.

1.2 方法

1.2.1 拟南芥的种植

将拟南芥各野生型和突变体的种子经消毒后撒在1/2MS固体培养基上(pH=5.8)，于4℃避光处理48h后转入22℃光照培养箱(16h光照，8h黑暗)中进行培养.7d后，将幼苗移栽到22℃温室(16h光照，8h黑暗)的培养土(蛭石、黑土和珍珠岩质量比为9∶3∶1)中继续培养.

1.2.2 花药的收集和RNA提取

6～7周龄生长状态良好的拟南芥WT，spl、bam1、bam2、bam1bam2突变体植株，解剖镜下收取其4～ 6期花药于液氮中.用试剂盒ZR plant RNA MiniprepTM kit(Zymo Research, https://www.zymoresearch.com/)提取总RNA.

1.2.3 转录组测序和数据处理

取超过500ngA260/A280在1.8～2.0的RNA进行文库构建，送到上海晶能公司用IlluminaTMHi-seq 2000 system(Illumina Inc.,http://www.illumina.com/)进行深度测序.所得数据经FastQC(Babraham Bioinformatics, http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)进行质控后，使用TopHat v2.0.8b[9]与拟南芥基因组(TAIR10，http://www.arabidopsis.org)进行比对，并用GFOLD[10]方法计算各基因在野生型和突变体中的表达水平(RPKM，Reads Per Kilo bases per Million reads)，GFOLD即为校正后的log2FC(FC，fold change，指基因在突变体与野生型中的表达量比值).显著差异表达基因的筛选阈值设置为1，取GFOLD>1为表达显著上调，GOLD<-1为表达显著下调.

1.2.4 差异基因功能分析

取FDR<0.05为阈值进行显著性检验.简单的数据统计利用Excel表格实现，其余用生物学信息软件完成:聚类分析使用k-means算法，热图绘制使用R语言中pheatmap函数，基因功能富集采用agriGO v2.0[11]在线网站(http://systemsbiology.cau.edu.cn/agriGOv2/index.php).

2 结果与分析

2.1 BAM1/2相关转录组的比较分析

以往的研究已知BAM1和BAM2功能冗余地调控花药早期发育过程，但两者之间是完全功能重叠还是有部分差异，并不清楚.为了明确这个问题，我们通过RNA-Seq的方法，分别获得了bam1、bam2和bam1bam23种突变体的花药转录组数据.分析发现，在bam1、bam2和bam1bam2中分别有237、424、799个基因的表达水平显著下调，25、99、318个基因的表达水平显著上调(图1(a))，表明这两个受体激酶在花药发育过程中发挥正向调控功能.共计1353个基因的表达水平在至少一种突变体中发生了2倍以上的显著变化(GFOLD>1或GFOLD<-1).其中980个基因的表达水平至少在一种突变体中显著下调(GFOLD<-1)，375个基因的表达水平至少在一种突变体中显著上调(GFOLD>1).其中，125个基因在单突变体和双突变体中均显著下调，13个基因在单突变体和双突变体中均显著上调(图1(a))，表明在调控这些基因的表达过程中，BAM1和BAM2同等重要.471个基因仅特异地在双突变体中显著下调，267个基因仅特异地在双突变体中显著上调(图1(a))，表明在调控这些基因的表达过程中，BAM1和BAM2的功能存在冗余性.继而，我们对3种突变体中分别下调和上调的差异基因进行了功能富集分析.结果表明，下调基因主要富集在花粉发育、花粉外壁形成、孢粉素合成、花药绒毡层发育和脂质转运等过程，而上调基因主要富集在胁迫及刺激响应、免疫过程、次级代谢、细胞死亡等过程(图1(b)).

图1 bam1/bam2/bam1bam2突变体花药中差异基因比较和生物学过程分析Fig.1 The comparison of genes differentially expressed in bam1/bam2/bam1bam2 anthers and biological processes analysisA:bam1/bam2/bam1bam2突变体花药转录组对比分析；B:3个突变体差异基因功能富集；C:差异基因k-means聚类分析.

为了进一步研究BAM1和BAM2调控下游基因时功能的冗余和独特性，我们将这1353个差异基因在3种突变体中的表达模式进行k-means聚类分析，将聚类而成的7组分别命名为G1～G7(图1(c)).G1组的111个基因在bam1、bam2、bam1bam2突变体中表达水平均和野生型差异明显，推测这批基因的正常表达需要BAM1和BAM2共同发挥功能，可能以BAM1BAM2受体复合物的形式发挥作用.G2组的569个基因在bam1bam2双突变体中的表达水平和野生型差异明显，而在bam1和bam2单突变体中几乎无差异，暗示在调控这部分基因的表达过程中，BAM1、BAM2功能完全冗余，可相互替代.G3组的115个基因在bam1和bam1bam2中表达水平和野生型差异明显，而在bam2单突变体中不明显，暗示在调控这部分基因的表达过程中，BAM1发挥主效应功能.G4组的160个基因在bam1bam2双突变体中的表达水平和野生型差异明显，在bam2单突变体中呈现微弱差异，而在bam1单突变体中则几乎无差异，暗示在调控这部分基因的表达过程中，BAM1和BAM2比BAM2的贡献更大.G5组的199个基因在bam1bam2双突变体中和bam2单突变体中表达水平相似，而在bam1单突变体中差异不显著，暗示在调控这部分基因的表达过程中，BAM2发挥主要作用.有趣的是，我们也发现G6中的165个基因在bam2中发生了非常明显的差异表达，而在bam1单突变体和bam1bam2双突变体中几乎都没有差异，以及G7中的34个基因在bam1中发生了较为明显的差异表达，而在bam2单突变体和bam1bam2双突变体中几乎都没有差异.对于这两组聚类可能的作用模式目前还很难推测，我们认为BAM2和BAM1可能分别在G6和G7类群基因的表达过程中发挥作用，但同时两个同源基因之间可能存在一定的拮抗或反馈调节作用.

2.2 BAM1/2调控花粉发育和脂质转运

我们对G1～G7各部分基因分别进行功能分析，发现G3组中的基因显著富集在花粉发育过程，主要是花粉外壁发育.花粉外壁保证小孢子内部结构的完整，并且保护小孢子免受高温、紫外辐射、物理损伤和病原体侵害的影响，因此花粉壁发育在植物雄性育性中发挥着重要功能[12].在花粉发育过程中，共15个花粉外壁形成基因的表达水平在bam1/bam2/bam1bam2突变体花药中发生了显著变化，除EFD外均显著下调，且大都分布在G3组，包括CYP703A2、CYP703B1、TKPR1、TKPR2、UPEX1、WBC27、ACOS5、LAP5等(图2(a))，暗示BAM1和BAM2调控这些基因时，BAM1发挥主效应功能.

除花粉外壁形成外，我们发现G1～G7中也出现了许多其他花粉发育相关基因，尤其是一些绒毡层发育相关的基因在突变体花药中发生了显著变化(图2(a)).绒毡层紧挨着小孢子母细胞，为小孢子母细胞发育提供必要的营养物质和信号分子，并且分泌孢粉素前体进而形成花粉外壁，因此绒毡层的发育异常通常都会影响花粉的育性[3,12-13].已知的研究表明，在绒毡层中，DYT1是最早发挥功能的基因，形成DYT1-bHLH010/089/091-MYB35-AMS-MYB103-MS1-MYB99信号通路调控绒毡层发育[3,13].在bam1/bam2/bam1bam2突变体花药中，bHLH091、MYB35、AMS、MYB103、MS1、MYB99的表达水平均显著下调(图2(a)).此类大部分分布在G2和G4，表明BAM1和BAM2可能功能冗余地调控绒毡层发育及功能相关的转录网络.

另外，G7中出现了两个特别的基因:MMD1和CDM1.MMD1是雄性减数分裂所必需基因，在减数分裂期间调控微管组建和细胞周期的过渡[14]，CDM1调控雄性减数分裂母细胞中胼胝质的合成、沉积和降解[15].MMD1和CDM1在bam1中显著下调，而在bam2和bam1bam2中变化水平相对很低(图2(a))，表明BAM1可能与雄性减数分裂有关，但同时BAM1和BAM2之间可能存在一定的拮抗或反馈调节作用.

脂质转运过程和花粉发育的结果类似，G3组中的基因显著富集在脂质转运过程，G2和G4也出现了一些相关基因.我们发现了23个脂质转运基因的表达水平在突变体中发生了显著差异.其中，LTP2、LTP3、LTP4、T20L15.140、ATATH14、T19P19.606显著上调，其余显著下调(图2(b)).

G1组中的基因显著富集在转录调控和蛋白质泛素化降解过程.转录调控过程中，NAC家族的AT1G60340、NAC095、T13D8.13、AT1G60300，以及C2H2家族的T20K14.90均显著下调；蛋白质泛素化降解过程中，含SKP1-like结构域的ASK5、ASK12、ASK13，以及含RING/U-box结构域的MWF20.13均显著下调(图2(c)).

G2组中的基因显著富集在对于胁迫和刺激的响应，包括抗干旱、抗病，毒素代谢、响应ABA等，另外也有一些基因显著参与了细胞壁组建过程，包括果胶裂解酶、果胶甲基酯酶、木葡聚糖水解酶、糖基水解酶等(图2(d)).

图2 G1～G7组中花粉发育、脂质转运、转录、蛋白质泛素化和细胞壁组建相关基因的表达变化Fig.2 The expression variation of genes involving in pollen development, lipid transport, transcription, protein ubiquitination, and cell wall organization in G1—G7(a) G1～G7组中花粉发育相关基因的表达变化；(b) G1～G7组中脂质转运相关基因的表达变化；(c) G1组中转录和蛋白质泛素化相关基因的表达变化；(d) G2组中细胞壁组相关基因的表达变化.

2.3 BAM1/2相关转录组和SPL相关转录组的比较分析

如前文所述，SPL是已知最早的调控花药发育的转录因子，且之前文章报道SPL和BAM1/2间可能存在负反馈调节.因此我们也通过测序的方式获得了spl突变体花药的转录组(图3(a)，见第404页).与野生型相比，spl中共有4580个基因的表达水平发生了显著变化，其中2067个基因显著上调(GFOLD>1)，2513个基因显著下调(GFOLD<-1)(图3(a)).我们将这4580个差异基因与bam1bam2双突变体中的1117个差异基因进行对比分析，发现694个基因在spl和bam1bam2中均显著下调，83个基因在两者均显著上调，仅有共计14个基因在两个突变体中变化方向相反(图3(b)和图3(c)).SPL和BAM1/2共同调控的下游基因中98.2%(777/791)的基因在两个突变体中作用方向相同，暗示两者作用于相同的信号途径且作用方向相同.同时，BAM1/2的1117个下游基因中，共计791个(70.8%)也受到SPL的调控，只有326个(29.2%)在SPL中无变化(命名为BAM1/2特异调控基因)；而SPL的4580个下游基因中仅有17.3%(791/4580)受到BAM1/2的调控，82.7%(3789/4580)在BAM1/2中无变化(命名为SPL特异调控基因)，暗示BAM1/2可能在SPL的遗传下游.

为了研究SPL和BAM1/2调控的生物学过程，我们将SPL和BAM1/2共同调控的下游基因、SPL特异调控基因、以及BAM1/2特异调控基因3个基因类群分别进行功能富集，发现SPL和BAM1/2共同调控的下游基因主要富集在花粉外壁发育、花粉发育、脂质转运和细胞壁组建过程，SPL特异调控基因主要富集在细胞壁组建、转录调控、信号转导、植物器官发育、激素代谢过程，BAM1/2特异调控基因和SPL特异调控基因都富集到在激素响应、脂质响应、次级代谢、水分响应等刺激和胁迫响应过程(图3(d)).

图3 bam1bam2和spl突变体花药中差异基因比较和生物学过程分析Fig.3 The comparison of genes differentially expressed in bam1bam2 and spl and biological processes analysis(a) spl突变体花药中基因的表达变化，红色代表相对于显著上调，绿色代表相对于显著下调，灰色代表无显著差异；(b) spl和bam1bam2突变体花药转录组对比分析；(c) SPL和BAM1/2共同调控的下游基因在bam1bam2和spl中的表达量热图；(d) SPL和BAM1/2共同调控的下游基因、SPL特异调控基因、以及BAM1/2特异调控基因3个基因类群的生物学过程富集分析，红色细线代表FDR=0.05的位置，为显著性检验的阈值.

2.4 SPL和BAM1/2共调花粉发育、脂质转运和细胞壁组建

受BAM1/2调控的1154个基因(G1～G5)中，bam1/bam2/bam1bam2突变体影响到了33个花粉相关基因的表达，且除EFD和PIRL2外均在bam1bam2突变体中显著下调，而这33个基因仅EFD和PIRL2的表达水平未在spl中显著变化，其余31个基因同时在bam1bam2和spl突变体中显著下调(图2(a)).脂质转运过程与花粉发育的结果类似，受BAM1/2调控的1154个基因(G1～G5)中，bam1/bam2/bam1bam2影响到了23个脂质转运相关基因的表达，除了LTP2/3/4、F15K19.1，T19P19.60，其余18个基因都在spl突变体中显著变化(图2(b)).以上结果表明SPL通过调控BAM1/2调控花粉发育和脂质转运.

除花粉发育和脂质转运，SPL和BAM1/2共调基因还显著富集在细胞壁组建过程(图3(d))，共有29个基因参与，其中23个基因都处于G2组，表明BAM1和BAM2功能完全冗余的部分在细胞壁组建过程中发挥着重要功能，这与前面的结果一致.G2组中共有33个基因参与细胞壁组建过程，同时受到SPL调控的基因共23个(69.7%)，表明BAM1和BAM2调控细胞壁组建的过程大部分都受到SPL的调控，仅有少部分未通过SPL(图2(d)).

2.5 SPL单独调控花(药)发育

在SPL特异调控基因中，虽然没有花粉发育过程的显著富集，但值得注意的是，有56个花粉相关基因的表达水平特异地在spl中显著变化(图4(a)).WUS和KNU基因调控花原基的发育[16]，AP3、SEP2、AG作为B基因调控雄蕊原基的发育[1]，这表明除调控花药孢原细胞分化之外，SPL还调控着更为早期的花原基和雄蕊原基发育过程.因此我们分析了从花原基到4轮花器官原基发育过程中一系列基因在spl突变体中的表达变化，发现近一半基因的表达水平都在spl突变体中显著变化(图4(b)).其中WUS和KUN显著下调，AP1/AP2/AP3/AG/SEP2显著上调，表明SPL能够促进WUS和KNU的表达，抑制AP1/AP2/AP3/AG/SEP2的表达.

图4 SPL特异调控基因在spl突变体花药中的表达变化Fig.4 The expression variation of genes uniquely regulated by SPL in spl(a) 花粉发育相关基因在spl突变体花药中的表达变化；(b) 花原基和花器官原基发育相关基因在spl突变体花药中的表达变化；(c) SPL特异调控基因中各家族转录因子数量的饼图；(d) BR相关基因在spl突变体花药中的表达变化；(e) 信号转导相关基因在spl突变体花药中的表达变化；(f) 生长素合成相关基因在spl突变体花药中的表达变化.(b)，(d)，(e)，(f)各图中红色虚线代表log2FC=1或-1的位置.

富含亮氨酸重复受体样蛋白激酶(LRR-RLKs)家族基因ER/ERL1/ERL2在spl突变体中显著上调，表明SPL调控细胞间的信号传递过程.在绒毡层发育过程中，DYT1与其结合蛋白基因bHLH010/bHLH089的表达水平在spl突变体中显著下调，表明SPL调控更为早期的绒毡层发育.另外，CEP1编码半胱氨酸蛋白酶，调控绒毡层细胞的程序性死亡[17]，CalS5编码胼胝质合成酶，调控胼胝质合成[18].CEP1、CalS5和转运子基因ABCG1/ABCG16也都在spl突变体中显著下调，而BR(油菜素甾醇，Brassinosteroids)信号途径中的细胞膜受体BRI1基因在spl突变体中显著上调(图4(a)).SPL特异调控基因类群中，最显著的生物学过程为转录调控(图3(d))，这与SPL编码MADS-box转录因子的功能一致.我们将SPL特异调控基因与拟南芥中已知的1717个转录因子基因进行比较，发现SPL特异调控着323个转录因子基因的表达，占已知转录因子基因的19%，其中182个基因显著上调，141个基因显著下调.我们对这些转录因子基因的家族进行分析(图4(c))，发现数目最多的是bHLH家族，共34个，除了DYT1/bHLH010/bHLH089外，还有ICE1/ICE2、PIF7/PIF6、KDR、CIB1、BNQ2等，其次是MYB和MYB_related家族.有趣的是，在BES1家族里，BEH1显著下调，BEH3显著上调.BEH1和BEH3是BR途径中核心转录因子BES1的同源蛋白，而BRI1也在spl突变体中显著上调，因此我们分析了BR途径中一系列关键基因在spl突变体中的表达变化，发现许多基因的表达水平都发生了显著变化，表明SPL与BR信号通路有一定的联系(图4(d)).

其次，有305个基因参与信号转导过程，共177个基因显著上调，128个基因显著下调.数目最多的是酪氨酸激酶信号途径相关基因，共45个，其中包括40个LRR蛋白激酶基因SKM1/SKM2/ZAR1/BAM3等，此外还包括MAP蛋白激酶基因MKK9/MPK14/MPK20，BR信号途径中的BRI1激酶抑制子基因BKI1和蛋白激酶基因BSK2/BSK6，和CLE家族CLE17/CLE27等(图4(e)).

另外，SPL与激素代谢有关，尤其是生长素合成过程，许多生长素相关基因的表达水平都在spl突变体中显著变化，包括合成生长素的YUC1/YUC4/YUC6(图4(f))，表明SPL和生长素和合成有一定的联系.

最后，有101个基因参与细胞壁组建过程，包括果胶裂解酶、果胶甲基酯酶、木葡聚糖水解酶、糖基水解酶和纤维素合成酶等,表明除了通过BAM1和BAM2之外，SPL也可单独调控细胞壁组建过程.另外，有181个基因参与植物器官的发育过程，包括叶子、叶原体、根、子叶和花器官的发育(图3(d)).

2.6 SPL和BAM1/2各自单独调控激素响应、脂质响应、次级代谢和胁迫响应过程

如图3(d)所示，SPL和BAM1/2各自通过不同的基因调控着激素响应、脂质响应、次级代谢，以及对于刺激和胁迫的响应过程.

在激素响应过程中，BAM1/2特异调控基因主要调控响应脱落酸、水杨酸和茉莉酸的基因表达，而SPL特异调控基因则并未特定响应某一种激素水平.在次级代谢过程中，SPL特异调控基因主要富集在苯丙素代谢过程，这与花粉壁形成有关，而BAM1/2特异调控基因则主要富集在毒素代谢过程.在胁迫响应中，除了水分响应外，BAM1/2特异调控基因还富集在因为生物刺激而引起的免疫防御反应、盐胁迫和细胞死亡，而SPL特异调控基因则富集在对于温度刺激和光刺激的响应.值得注意的是，以上这部分BAM1/2特异调控基因中，绝大多数基因都在G2组，这与前面的结果一致.比如，BAM1/2调控细胞死亡过程中，有10个基因参与细胞死亡，且均在G2组.

另外，G1组中有些基因显著参与转录调控和蛋白质泛素化降解，除LBD36外，其他基因都在spl突变体中显著下调，表明BAM1和BAM2调控这部分基因从而参与转录调控和蛋白质泛素化降解过程是受到SPL调控的.

2.7 SPL和BAM1/2调控的下游信号通路网络和已知的花药发育网络

基于以上结果，我们构建出SPL和BAM1/2调控下游基因的信号通路(图5).SPL单独调控花原基和花药原基发育、转录调控、信号转导、植物器官发育、细胞壁组建、生长素合成、苯丙素合成和对于刺激、胁迫的响应等过程，BAM1/2单独调控对于刺激和胁迫的响应过程，而SPL通过BAM1/2调控花粉发育和花粉外壁发育、脂质转运、细胞壁组建、转录调控和蛋白质泛素化降解过程.

图5 SPL和BAM1/2调控的下游信号通路网络Fig.5 The downstream signaling network regulated by SPL and BAM1/2

在已知的花药发育信号网络中，大多数比较后期的花药发育基因都是SPL通过BAM1/2调控的.SPL通过BAM1/2促进下游bHLH091/MYB35/AMS/MYB103/MS1/MYB99信号通路来调控绒毡层的发育，进而影响CYP703A2/CYP704B1等基因的表达调控花粉外壁形成，另一方面也促进QRT3基因表达，影响四分体的形成[19].而SPL不通过BAM1和BAM2的部分，则主要通过WUS/KUN和AP3/SEP2/AG调控早期花原基和花药原基发育，通过ER/ERL1/ERL2调控细胞间信号传导，通过DYT1/bHLH010/bHLH089调控更早期的绒毡层发育，通过CALS5调控胼胝质合成，以及通过ABCG1/ABCG16调控细胞间的物质运输(图6).

图6 SPL和BAM1/2调控的花药发育信号网络Fig.6 The downstream signaling network of anther development regulated by SPL and BAM1/2

3 讨 论

花药发育是一个复杂的调控网络，从早期孢原细胞分化到后期绒毡层发育和小孢子减数分裂，一系列基因都在发挥作用，如SPL、BAM1/2、DYT1、MYB35等.SPL和BAM1/2是目前已知的花药发育基因中最早发挥功能的，其突变体花药表型缺陷也最为严重，但关于两者之间的关系和下游信号通路了解却非常有限.本课题研究发现SPL通过BAM1/2调控花粉外壁发育、花粉发育、脂质转运和细胞壁组建，同时SPL独立于BAM1/2调控花原基和花药原基早期一些基因的表达(图5).

对于BAM1、BAM2这一对同源基因，从图1(c)我们可以看出，BAM1和BAM2在进化过程中除了作为一个整体行使相同的功能(调控G1组基因)，也存在完全的功能冗余(调控G2组基因)，和亚功能化(G3～G5组基因)，另外同时可能发生了新功能化(G6～G7组基因).

3.1 SPL和BAM1/2共同调控花药早期发育过程

相对于bam1bam2，SPL基因突变体表型异常出现时期更早，而本文中我们的转录组数据也发现，SPL调控了更多的下游基因的表达(4580).相比于BAM1/2下游基因中70.8%都同时被SPL调控，SPL中只有17.3%的基因同时位于BAM1/2下游(图3(b))，表明两者都参与调控一些相同的信号途径，但BAM1|2位于SPL的下游.

SPL和BAM1/2之间的负反馈环路，前人的研究结果表明BAM1/2能够抑制SPL表达，但这只是一种猜想，缺少直接的实验证据.这种观点源于在bam1bam2突变体花药中，SPL表达范围的增大[3,8].在几乎所有L2层细胞分化而来的细胞群中，SPL都有表达.根据本文中转录组数据，这可能是因为bam1bam2突变体L2层细胞全部分化为类似于小孢子母细胞的细胞群而引起的SPL表达范围增大.本课题研究发现，在spl突变体花药中，BAM1和BAM2的表达水平变化分别0.26和0.18，并未显著变化，表明SPL和BAM1/2之间可能并不存在直接的调控关系.在BAM1/2和SPL共调基因中，98.2%(777)的基因在bam1bam2和spl突变体中变化方向相同，仅有14个基因变化方向相反(图3(c))，这表明SPL正调BAM1/2调控下游基因和信号通路，并未观察到BAM1/2对SPL表达的抑制.由此推测，前人由观察到SPL在bam1bam2突变体花药中表达范围扩大而推测出可能存在BAM1/2抑制SPL表达范围的负反馈调控环的存在，这一推论可能有待商榷.一种可能是如前文中所讨论，BAM1/2缺失，导致SPL表达范围扩大，从而形成更多造孢细胞；但并不能排除另一种可能，即在bam1bam2突变体中由于更多细胞分化为造孢细胞，而SPL在造孢细胞中表达，因而观察到SPL表达范围更广.当然，明确是哪一种可能，仍需要进一步深入研究.

3.2 SPL和BAM1/2分别具有独立于彼此的功能

除了调控已知的花药发育基因(图6)，SPL和BAM1/2具有各自特异的独立于彼此的功能(图5).如图5所示:BAM1/2单独调控着对脱落酸、水杨酸和茉莉酸等激素的响应、脂质响应、毒素等物质的次级代谢以及胁迫响应过程，并且绝大多数是BAM1和BAM2是以G2模式来调控的，即完全功能冗余.SPL在转录调控方面发挥着重要作用，影响了323个转录因子的表达，并调控信号转导、细胞壁组建、植物器官发育、生长素合成、激素响应、脂质响应、苯丙素等物质的次级代谢以及胁迫响应过程.在胁迫响应中，除水分响应外，BAM1/2还参与因生物刺激而引起的免疫防御反应、盐胁迫响应和细胞死亡，而SPL则参与对于温度刺激和光刺激的响应.在BAM1和BAM2是以G1模式来调控时，即BAM1和BAM2共同调控时，许多基因受SPL-BAM1/2调控参与转录调控和蛋白质泛素化降解过程.

在SPL单独调控的花发育基因中，我们观察到一些BR途径相关基因的表达发生了显著差异，包括接收来自膜外信号的膜受体激酶基因BRI1、BRI1激酶抑制子基因BKI1、将BRI1的信号向膜内传导的BSK2和BSK6，BR途径核心转录因子基因BES1的同源基因BEH1和BEH3、14-3-3蛋白基因GRF13、合成BR的DWF7/BEN1/CYP708A3/CYP707A1(图4(d)).已知的研究结果表明BR途径影响植物的雄性育性，且BES1能够直接结合到SPL的启动子上[20].在BZR1/BES1及其同源家族基因缺失形成的六突bzr-h中，SPL几乎检测不到，表明BR途径能够影响SPL的表达从而调控花药发育[21].

除了雄蕊发育，SPL也调控雌蕊发育.在spl突变体中，胚珠的孢原细胞特异化正常，但不能分裂形成大孢子母细胞[5].在花原基发育方面，SPL影响ABCE模型中B基因和C基因的表达来控制雄蕊原基发育.AG能激活SPL[22]，SPL异位表达和过表达引起SEP3表达上升[23]，SEP3异位表达激活AG和AP3的表达[24,25]，这些数据表明SPL在参与雄蕊原基建成时一直是正调控的角色，还未发现SPL直接负调这些基因的结果.

此外，在本课题研究中，我们发现ABCE基因中大多数都在spl突变体花药中上调，只有CLV3、SEP3和SEP4没有变化，其中A基因AP2和AP1，B基因AP3，C基因AG，E基因SEP2显著上调(图4(a))，表明SPL可能抑制这些基因的表达从而调控4轮花器官原基发育.同时花原基分化基因WUS和KNU显著下调，可能与AG的上调有关，或者是SPL通过其他基因调控的.

之前的研究发现，在拟南芥的花、萼片、花瓣和莲座叶中，SPL异位表达和过表达引起AG表达上升，文章推测可能是通过SEP3来激活AG表达，而在本课题的研究中，我们发现在拟南芥的花药中，AG的表达水平在spl突变体显著上升，这表明SPL与AG之间可能有比较复杂的调控关系.

3.3 SPL参与信号传导

MPK3和MPK6是MAPK家族中的重要蛋白激酶，在细胞间信号传导过程中起着重要作用[13].之前的研究结果表明MPK3和MPK6能和SPL相互作用且磷酸化SPL，而这种磷酸化是SPL调控花药发育所必需的[26].突变体表型数据暗示ER/ERL1/ERL2和MPK3/MPK6之间有一定的关系，可能ER家族基因会将膜外信号通过MAPK级联反应向下传递，但具体通路并不清楚[3].在花药发育信号传导过程中，我们发现ER/ERL1/ERL23个基因的表达水平都在spl突变体花药显著上调，这表明SPL抑制了ER/ERL1/ERL2的表达，从而阻断ER/ERL1/ERL2通过MPK3/MPK6向下游传递信号的过程.除此之外，SPL的突变还影响了40个LRR蛋白激酶的表达，包括27个上调，13个下调，表明SPL在细胞的信号传导过程中发挥着重要作用，并且大部分是阻断信号传导，小部分是促进信号传导.

综上所述，本文采用高通量转录组测序技术，发现了大量受SPL和BAM1/2调控的基因和下游通路，为后续研究提供了详尽的参考数据.相信后续结合细胞学、生化学、遗传学等手段，能够进一步解开拟南芥花药发育的信号网络，为推动农业生产提供重要的理论依据.