黄 莹 覃爱平

(1 广西南宁市妇幼保健院生殖医学中心，南宁市 530011,电子邮箱:xiaoyaodu1986@163.com；2 广西医科大学第一附属医院生殖医学研究中心，南宁市 530021)

随着越来越多的女性推迟生育计划，以及我国“二孩政策”的全面开放，我国许多高龄妇女有生育要求。《中国高龄不孕女性辅助生殖临床实践指南》[1]将≥35岁定为女性生殖高龄。但在高龄女性行超促排卵治疗中，常常出现获卵数少、受精异常的情况[2-4]。2011年欧洲人类生殖及胚胎学会和美国生殖医学会制定了卵巢低反应(poor ovarian response，POR)的诊断共识——博洛尼亚共识，POR的诊断标准之一是常规促排卵方案获卵数≤3个[5]。而在2012年由美国生殖医学协会和辅助生殖技术协会制定的关于非男性因素卵胞浆内单精子显微注射 (intracytoplasmic sperm injection，ICSI)应用共识[6]中，将获卵数≤6个归到“获卵数少”的范畴。

对于卵母细胞获得量少的高龄患者，避免胚胎的损失至关重要，因此，选择最有效的受精方式来增加胚胎成功活产的概率至关重要。早在1998年，就有学者[7]提出，由于ICSI具有高受精率，因此可在高龄低获卵女性中采用ICSI进行授精，即使这些女性并没有因为男性因素而不孕。但ICSI的受精过程是将精子注射到卵母细胞胞浆内，规避了自然的选择，而且作为一种有创性的操作，可能会对卵母细胞造成损伤，所以在高龄、低获卵、非男性因素不孕的女性中采用ICSI作为授精方式仍存在争议。本文回顾分析分别行常规体外受精(invitrofertilization,IVF)和ICSI受精的高龄女性患者的临床资料，比较两种方法的受精结果、胚胎发育和妊娠情况，探讨ICSI能否改善高龄低获卵患者的助孕结局，旨在为此类患者选择科学合理的授精方式提供参考。

1 资料和方法

1.1 临床资料 选取2011年1月至2018年12月在广西医科大学第一附属医院生殖医学中心就诊，因输卵管因素不孕行IVF-胚胎移植(embryo transfer,ET)助孕的150例高龄女性患者，回顾性分析其超促排卵低获卵周期的资料，按照授精方式分为IVF组101例和ICSI组49例。纳入标准：(1)年龄40～45岁；(2)采用黄体期长效长方案超促排卵治疗；(3)获卵数≤5枚；(4)男方体外排精；(5)新鲜胚胎移植(移植D3胚胎)。排除标准：(1)男方严重少、弱、畸形精子症，其中重度少精子症为3次精液检查中，两次精子密度<5×106/mL；重度弱精子症为3次精液检查中，两次前向运动精子比率<10%；重度畸形精子症，严格按精子形态学标准，在3次精液检查中，两次正常形态精子<1%,且为原发不育。(2)部分ICSI(half-ICSI)周期。(3)不明原因的前次IVF完全受精失败或受精率<30%。(4)多囊卵巢综合征患者。(5)染色体异常。(6)既往卵巢手术史、化疗及放疗史。(7)子宫内膜异位症、子宫腺肌症。(8)宫腔形态异常、输卵管积水。

1.2 治疗方法 两组均采用黄体期长效长方案作为控制性超排卵方案。在治疗周期的黄体中期(月经规律者：周期第20天或排卵后3～5 d；月经不规则者：口服避孕药第15天后)，开始应用长效促性腺激素释放激素注射用醋酸曲普瑞林(达菲林，益普生生物技术公司，3.75 mg/支)肌肉注射,使用剂量根据患者体重个体化决定(1.0～1.5 mg)。促性腺激素(gonadotropins，Gn)启动需要同时满足以下几个条件：(1)降调14 d左右。(2)明确垂体已达到抑制状态及无妊娠；当日查血性激素促卵泡激素(follicle-stimulating hormone,FSH)<5 IU/L、黄体生成素(luteinizing hormone,LH)<5 IU/L、雌二醇<50 pg/mL，内膜厚度≤5 mm。Gn常规启动剂量根据患者的年龄、双侧窦卵泡数目、基础FSH水平、体表面积及既往治疗周期用药情况综合决定。卵巢刺激4～5 d后开始用B超监测卵泡发育和雌二醇水平：当卵泡直径<10 mm，可3～4 d监测1次；当卵泡直径10～15 mm，可每2～3 d监测1次；当优势卵泡>15 mm，可每1～2 d监测1次。监测子宫内膜的厚度、形态以及子宫肌瘤等病理征象的变化。期间根据卵泡数量、生长速度和血中的FSH、LH、雌二醇、孕激素水平调整Gn用量。当2～3个主导卵泡直径达到18 mm，当日抽血查性激素FSH、LH、雌二醇、孕激素水平。使用人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)4 000～10 000 IU或者重组hCG 250 μg进行扳机。一般于注射hCG或重组hCG 34～36 h后取卵。

精液标本采用手淫取精，采用上游法处理新鲜精液样本。卵母细胞收集后2～6 h内完成受精。IVF组：每个卵周围放置约2万～4万条活动精子；ICSI组：将卵丘复合体去除卵丘细胞核放射冠，检查卵子的成熟度，使用MⅡ卵进行ICSI操作，精子制动后注入卵细胞，转入受精培养皿中孵育。IVF后16～20 h，观察受精情况，受精25～27 h后观察早卵裂情况，72 h后观察记录胚胎分裂情况并进行评分。取卵后第3天移植D3胚胎。从取卵日开始黄体支持(黄体酮注射液肌内注射40～60 mg/d，1次/d)，用至验孕日。移植后第12～14天查血β-hCG，证实妊娠后继续应用黄体支持(剂量、用法同上)至胚胎移植后4～6周，行早孕B超。早孕B超证实宫内是否有孕囊、孕囊个数、有无胚芽及心管搏动，是否为异位妊娠。确定宫内妊娠后考虑逐步减量，至妊娠10～12周停止黄体支持。

1.3 胚胎分级标准 IVF后25～27 h观察并记录早卵裂情况，IVF后72 h观察并记录胚胎分裂情况并进行评分。参考辅助生殖技术协会的胚胎评分系统[8]进行分级：(1)1级，细胞大小均匀，形态规则，透明带完整，胞质均匀清晰，没有颗粒现象，或/和碎片所占体积小于卵周间隙的5%；(2)2级，细胞大小略不均匀，形状略不规则，胞浆折光性轻微改变，可有颗粒现象，或/和碎片所占体积小于卵周间隙的20%但≥5%；(3)3级，细胞大小明显不均匀，明显的形状不规则，可有颗粒现象，或/和碎片所占体积小于卵周间隙的50%但≥20%；(4)4级，细胞大小严重不均匀，大量碎片，碎片≥卵周间隙的50%，卵浆色黑。第1天观察到的正常受精[即出现2个卵原核(2 pronucleus,2PN)]、第3天胚胎的评分达到1、2级，并且胚胎的卵裂球细胞数目≥4个，评为可移植胚胎；第3天胚胎的评分为1、2级，并且胚胎的卵裂球细胞数目≥6个，评为优质胚胎。

1.4 观察指标 (1)一般资料：女方年龄、男方年龄、女方体质指数、不孕类型、不孕年限。(2)治疗相关临床资料：基础FSH、窦卵泡、Gn使用天数及用量，hCG日血清LH、雌二醇、孕酮，男方精液相关检查(取卵日精子浓度、精子前向运动百分率)，以及获卵数、2PN数、2PN卵裂胚胎数、可移植胚胎数、优质胚胎数、移植胚胎数。(3)受精和胚胎情况、妊娠结局：正常受精率、D3优胚率、着床率、临床妊娠率、早期流产率、活产率。计算方法[9]：IVF正常受精率=D1出现2PN卵子数/IVF加精卵子总数×100%，ICSI正常受精率=D1出现2PN卵子数/注射MⅡ卵子总数×100%；D3优胚率=D3优质胚胎数/正常受精卵裂胚胎数×100%；着床率=孕囊数/移植胚胎数×100%；临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数×100%；早期流产率=孕12周内自然流产周期数/临床妊娠周期数×100%；活产率=活产的分娩数/移植周期数×100%。

1.5 统计学分析 采用SPSS 22.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料以(x±s)表示，组间比较采用t检验，不符合正态分布的计量资料以M(P25,P75)表示，组间比较采用秩和检验；计数资料以例数(百分数)表示，组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组患者一般资料及治疗相关临床资料比较 两组的女方年龄及体质指数、男方年龄、不孕类型、不孕年限差异无统计学意义(均P>0.05)，治疗相关临床资料差异无统计学意义(均P>0.05)，提示两组患者具有可比性，见表1～2。

表1 两组患者一般资料比较

表2 两组患者治疗相关临床资料比较

组别n精液浓度(x±s,百万/mL)精子前向运动百分率(x±s,%)获卵数(x±s,个)2PN数(x±s,个)2PN卵裂胚胎(x±s,个)可用胚胎数(x±s,个)优质胚胎数[M(P25,P75),个]移植胚胎数(x±s,个)IVF组101109.78±50.7548.08±14.153.21±1.372.37±1.172.27±1.162.19±1.101(0,2)1.88±0.73ICSI组49104.99±63.7143.69±15.633.51±1.282.35±1.202.35±1.202.22±1.161(0,2)1.92±0.76 t/z值0.4981.719-1.2930.094-0.391-0.186-0.426-0.290P值0.6190.088 0.1980.925 0.697 0.852 0.670 0.772

2.2 两组患者受精、胚胎情况和妊娠结局比较 两组患者在正常受精率、优胚率、着床率、临床妊娠率、早期流产率和活产率差异均无统计学意义(均P>0.05)，见表3。

表3 两组患者受精、胚胎情况和妊娠结局比较

3 讨 论

ICSI选择已经排出第一极体的MⅡ期卵母细胞进行操作，但是第一极体排出代表卵母细胞核已经成熟，并不代表细胞质的成熟。细胞质和细胞核均成熟的卵母细胞才有受精能力[10]，所以ICSI选择的MⅡ期卵母细胞并不全是细胞核和细胞质都成熟，可能存在细胞核和细胞质成熟的不同步。而在常规IVF中，直到授精后16～18 h才检查卵母细胞的成熟度，卵丘细胞复合体在培养中保持完整，允许更多的卵母细胞完成成熟并随后受精。由此可见，由于人为挑选出来的MⅡ期卵母细胞可能存在细胞核和细胞质成熟的不同步，因此常规IVF中的卵母细胞的自然成熟度可能优胜于ICSI的MⅡ期卵母细胞。

近年有大量的回顾性研究比较了常规IVF和ICSI两种受精方式对子代出生缺陷和子代发育、健康状况的影响，但所得结论不尽相同，仍存在争议[11-12]。多数的观点认为，与常规IVF相比，因严重男性因素不孕行ICSI助孕夫妇的子代的泌尿生殖系统出生缺陷更高，而因非严重男性因素不孕行ICSI助孕夫妇的子代出生缺陷则无显著差异[13-19]。目前针对子代发育、健康状况的研究还存在不足，因随访年限较短，无法精确判断ICSI安全性。同时ICSI的医疗费用更高，加重了不孕患者的经济负担，使得不孕患者再进行治疗的依从性下降。本研究中，常规IVF组和ICSI组的一般资料及治疗相关临床资料差异均无统计学意义(均P>0.05)，说明两组具有可比性；在此基础上，两组的正常受精率、早期流产率、优胚率、着床率、临床妊娠率、活产率差异并无统计学意义(均P>0.05)，这与既往研究[20-21]结果相似。说明ICSI与常规IVF临床效果相当。

胚胎学家们在进行ICSI时会选择形态正常的活动精子，但因为不能确定新鲜活动精子上有无碎裂或变性的DNA，所以不能避免选到异常精子的风险；此外，ICSI绕过了受精过程的大部分步骤，质量差的卵母细胞可以通过ICSI获得正常受精，这可能导致临床妊娠不成功或妊娠后出现早期流产。另一方面，常规IVF是一个精卵自由选择的偏向自然的过程，而ICSI是侵入性的机械操作，精卵被动结合，如果ICSI操作时损伤了赤道板，使分裂中期的细胞受损，或者是一些难以觉察的细小损伤，它们的发育潜力都有可能会迅速下降。这也许可以解释在本研究中，尽管ICSI组的正常受精率较IVF组稍高，但仍然无法获得更好的优胚率、着床率和活产率的原因。

综上所述，从有效利用有限的卵母细胞、改善助孕结局的出发点来说，高龄、低获卵数、非男性因素不孕的患者应用ICSI并不比常规IVF更具有优势。