朱庆贺，苗艳，杨旭东，王爽，张鹏宇，陈曦，王观悦，史同瑞

(黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院，黑龙江齐齐哈尔 161005)

4型禽腺病毒是指禽腺病毒1亚群血清4型，能够引起鸡心包积水。该病的特征性症状为心包出现淡黄色透明液体，同时也会出现如肝脏肿胀、肾脏水肿、尿酸盐沉积等临床症状，因此临床中称为鸡心包积水综合征。该病最早在巴基斯坦的安卡拉首先被报道，因此又称安卡拉病，其后在斯洛伐克、印度、墨西哥、秘鲁、俄罗斯、孟加拉国、韩国相继出现[1]。2006年该病第一次在中国被报道[2]，2015年7月开始在我国的河南、河北、新疆、安徽、山东、江西、湖北和江苏等省份迅速传播[3-4]。该病主要发生在炎热湿润的夏季，但其他季节也可零星发生，发病率和死亡率可高达40%～90%[5]。自2016年以来黑龙江省部分地区出现流行[6]，给该省养鸡业造成严重经济损失。鉴于当前4型禽腺病毒的严重情况，迫切需要研发针对性疫苗，以加强对4型禽腺病毒感染的有效防控。因此，本研究利用在黑龙江省发病鸡场分离的4型禽腺病毒(HLJ1701株)进行了灭活疫苗的研制。

1 材 料

1.1 毒株 4型禽腺病毒(HLJ1701株)由黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院兽药研究室分离并保存。

1.2 实验动物 SPF鸡胚、种蛋及SPF雏鸡购自哈尔滨维科生物技术有限公司，自行孵化至适合日龄使用。

1.3 佐剂 注射用白油、司本-80、吐温-80，均购自天津市巴斯夫化学试剂有限公司。

2 方法

2.1 抗原制备 4型禽腺病毒(HLJ1701株)用生理盐水作104倍稀释，经尿囊腔接种9日龄SPF鸡胚，0.2 mL/枚，置37 ℃孵育72 h，24 h内死亡为非特异性死亡，废弃不计，收获后测定LD50应不小于10-5.49。按照以上方法分别制备3批病毒液，批号分别为FAdV4-1、FAdV4-2、FAdV4-3。

2.2 病毒液灭活 4型禽腺病毒(HLJ1701株)病毒液中加入甲醛(终浓度0.3%)，37 ℃灭活24 h，灭活后的病毒液置于2～8 ℃保存。

2.3 半成品检验

2.3.1 无菌检验 按照《中华人民共和国兽药典》(2015版)对样品进行检验，应无细菌生长，检验不合格应废弃。

2.3.2 病毒含量测定 将灭活前的病毒，做10倍系列稀释，0.2 mL/只定量接种2周龄SPF鸡，每个稀释度接种6只，观察记录实验动物死亡数，直至攻毒后14 d，计算各稀释度死亡实验动物的百分率。按Reed-Muench法计算LD50。

2.3.3 灭活检验 取灭活后的HLJ1701株病毒液，尿囊腔内接种9～11日龄SPF鸡胚10枚，每胚0.2 mL，37 ℃继续孵育，剔除24 h内死亡鸡胚，观察3日，鸡胚非特异性死亡不应超过2枚。收获所有鸡胚的胚液，颈部皮下接种10只2周龄SPF鸡胚，应全部无异常。

2.4 疫苗配制

2.4.1 油相制备 取优质注射白油96份，司本-80 4份。先将白油缓缓加温，加入4%的司本-80，边搅拌边加温，直到充分溶解至透明，高压灭菌备用。

2.4.2 水相制备 取疫苗抗原(灭活鸡胚尿囊液)96份加入灭菌后的吐温-80 4份，开始搅拌直至全部溶解为止，制成水相。

2.4.3 乳化 将油相与水相按2∶1的比例利用IKA乳化机25000 r/min乳化5 min。批号分别为20170711、20170824、20170913。

2.5 成品检验

2.5.1 性状 按照《中华人民共和国兽药典》附录对疫苗的外观、剂型、稳定性和黏度等性状进行检验。

2.5.2 装量检查 按《中华人民共和国兽药典》附录进行装量检查。

2.5.3 无菌检验 按《中华人民共和国兽药典》附录进行无菌检验。

2.5.4 安全检验 取3周龄SPF鸡15只，每只肌肉或颈部皮下注射疫苗1 mL，观察14 d，记录是否出现局部或全身不良反应。

2.5.5 效力检验

2.5.5.1 血清学方法 取3周龄SPF鸡40只，其中30只分别利用3批次疫苗进行颈部皮下接种，每批次10只，0.2 mL/只，另10只作不免疫接种对照。接种后21 d，分别采血分离血清，使用ELISA检测抗体效价。

2.5.5.2 免疫攻毒法 取3周龄SPF鸡40只，其中30只分别利用3批次疫苗进行颈部皮下接种，每批次10只，0.2 mL/只，另10只作不免疫接种对照。接种后21 d，将免疫鸡连同10只对照鸡，分别通过皮下接种病毒液，0.2 mL/只(含100 LD50)，连续观察10 d后分别采集试验鸡的肝脏组织进行病毒分离。

3 结果与分析

3.1 半成品检验 在实验室条件下连续制备了3批病毒液，批号分别为FAdV4-1、FAdV4-2、FAdV4-3。检验结果显示，3批病毒液的病毒含量(LD50)在10-5.49～10-5.66之间，病毒液经0.3%甲醛液在37 ℃灭活24 h后，均可灭活完全(表1)。

表1 病毒液半成品检验结果Tab 1 The detecting result of virus antigen

3.2 性状检验 经检验，制备的3批4型禽腺病毒灭活疫苗批号分别为20170711、20170824、20170913均为乳白色乳剂，油包水型，将疫苗置3000 r/min离心15 min，管底无水相析出，3批疫苗的黏度均在50 cP以内(表2)。

表2 3批实验室制品性状检验结果Tab 2 The physical characteristics result of 3 batch of products

3.3 装量检查 经检查，所制备的3批次4型禽腺病毒灭活疫苗的装量均为250 mL以上，符合规定(表3)。

表3 装量检查结果Tab 3 Filling inspection results

3.4 无菌检验 经检验，所制备的3批4型禽腺病毒灭活疫苗均无细菌生长，检验合格。

3.5 安全检验 将所制备的3批4型禽腺病毒灭活疫苗分别经颈部皮下接种3周龄SPF鸡，试验鸡接种后均全部健活，未出现局部或全身不良反应。

3.6 效力检验 试验结果显示，3批4型禽腺病毒灭活疫苗免疫3周龄SPF鸡后21 d，抗体平均效价可达到28以上，使用4型禽腺病毒(HLJ1701株)进行攻毒，攻毒后各免疫鸡均全部存活，攻毒10 d后分别采集试验鸡的肝脏组织进行病毒分离，均为阴性，3批疫苗对免疫鸡的攻毒保护率均为100%；对照鸡在攻毒后4 d内均全部发病死亡(表4和表5)。

表4 抗体检测结果Tab 4 Results of Antibody test

表5 3批4型禽腺病毒灭活疫苗对HLJ201701株的攻毒保护试验Tab 5 The result of virus challenge experiment with strain HLJ201701 of 3 batch virus vaccine

4 讨论与结论

不同于其他大部分禽类病毒，4型禽腺病毒不具备使鸡、大鼠和小鼠红细胞凝集的能力[7]，不过Manzoor S 利用人O型红细胞血凝抑制试验进行了野生鸟类中4型禽腺病毒的血清抗体情况调查[8]，说明4型禽腺病毒能够使人O型红细胞凝集，但是人O型红细胞获取较为困难，不适宜生物制品生产的实践应用，因此本研究未应用凝集试验进行抗体滴度检测。ELISA方法是实验室诊断中常用的抗体检测方法[9-10]，本研究中利用黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院兽药研究室建立的ELISA方法对疫苗抗体进行了检测[10]，结果表明ELISA检测方法可以完成疫苗抗体检测任务，而且灵敏度高，测定准确。

目前已有其他4型禽腺病毒灭活疫苗制备的报道[11-13]，但疫苗免疫成功最主要的因素之一就是免疫毒株基因型的吻合。本研究利用黑龙江地区4型禽腺病毒分离株HLJ1701进行了灭活疫苗的研制，利用MEGA7软件进行分离株HLJ1701遗传进化分析，结果显示分离株序列与国外的分离株同源性差异较大，与加拿大分离株(GenBank: GU188428.1)核苷酸序列同源性仅为96.00%，氨基酸同源性仅为88.70%；与Meng K等[13]用于制备灭活疫苗的中国山东分离株(GenBank: MN102413.1，分离于2017年8月)核苷酸同源性较高，为98.80%，但氨基酸同源性仅为91.40%，其中hexon蛋白第367-395位氨基酸序列有明显差异。不同地区分离毒株序列可能具有地域特异性，基因序列的差异引起氨基酸序列的改变，进而影响蛋白质结构，尤其是具备抗原决定簇的hexon蛋白的改变极大可能影响疫苗的免疫效果，因此利用本地区毒株进行疫苗制备更具地域优势，也更具有针对性。本研究利用黑龙江地区分离毒株制备疫苗可能更适于黑龙江地区4型禽腺病毒的免疫防治。

本研究利用分离株HLJ1701进行了灭活疫苗的研制，结果表明自制的灭活疫苗均符合药典规定，而且疫苗的保护率达到100%，可以为临床4型禽腺病毒的疫苗制备及临床防控提供参考。