潘建刚，张华伟，陈波，周明光，王召贺，徐高原

(武汉科前生物股份有限公司，武汉 430070)

猪链球菌(Streptococcussuis)可引起猪脑膜炎、关节炎、心内膜炎、败血症、肺炎和突然死亡[1-2]，严重危害着养猪业的发展。根据荚膜多糖抗原的差异，可将其分为35个血清型，即1～34及1/2型[3]。对猪致病性较强的有猪链球菌1 型、2 型、7型和9型，尤其是猪链球菌2 型，不仅对猪的致病性最强，而且可感染特定人群并致死，是一种重要的人畜共患病病原菌[4]。本试验从我国部分猪场分离出1株2型猪链球菌，鉴定菌株7种毒力因子基因，并用分离菌株进行了小鼠致病性试验，以期为猪链球菌2型疫苗的研究提供必要条件和有利数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 2014-2016年从全国部分猪场采集疑似猪链球菌感染病例脑样品，脑组织有明显的肉眼可见出血，共20份。

1.1.2 猪链球菌培养基 TSA(Tryptic Soy Agar)、TSB(Tryptic Soy Broth)培养基购自BD生物科技有限公司。

1.1.3 主要试剂 新生牛血清购自内蒙古金源康生物工程有限公司；革兰氏染液购自南京建成科技有限公司；引物合成及基因测序由擎科新业生物技术有限公司完成。

1.1.4 细菌基因组DNA提取试剂盒 购于北京庄盟国际生物基因科技有限公司。

1.1.5 试验动物 18～22 g的昆明鼠，购自湖北省实验动物中心。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离 将采集的20份脑样品，分别于无菌操作台中使用接种环挑取部分组织，均匀涂划在加有5%新生牛血清的TSA平板中，于37 ℃条件下培养24 h，观察结果。24 h后于无菌条件下挑取平板上的疑似菌落划线接种于5%新生牛血清的TSA平板上，于37 ℃条件下培养24 h，观察细菌形态。

1.2.2 PCR鉴定

1.2.2.1 DNA提取 用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA，-20 ℃以下保存备用。

1.2.2.2 PCR引物 选取猪链球菌属保守基因gdh(谷氨酸脱氢酶)，血清型特异性基因cas2J(荚膜多糖)以及7种主要毒力因子fbps(纤连蛋白原结合蛋白)、sly(溶血素)、orf2(毒力相关因子)、mrp(溶菌酶释放蛋白)、89k(毒力岛)、gapdh(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)和epf(胞外因子)基因，参考文献设计引物[5-9]，引物序列见表1。

表1 猪链球菌引物Tab 1 Primer of Streptococcus suis

1.2.2.3 PCR检测及测序分析 PCR扩增体系：10×buffer 5.0 μL，dNTP(2.5 mmol/L)4.0 μL，引物P1(10 μmol/L)1.0 μL，引物P2(10 μmol/L)1.0 μL，模板DNA 2.0 μL，Taq酶(5 U/μL)0.25 μL，加注射用水至50 μL；反应条件为：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环，72 ℃终延伸10 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳。用DNA回收试剂盒回收PCR产物，将该PCR产物连接pMD18-T载体，送擎科新业生物技术有限公司测序，并与BLAST上的相关序列比较分析。

1.2.3 形态观察 按常规方法对分离菌株进行革兰氏染色，普通光学显微镜下观察菌体形态特征。

1.2.4 生长曲线的测定 分离菌株接种TSB液体培养基，37 ℃培养8～10 h作为种子液。再将上述种子液按培养基总体积的2%接种TSB培养基，于37 ℃摇床170 r/min振荡培养。其间每隔2 h取样进行活菌计数，监测24 h。

1.2.5 小鼠致病性试验 采用半数致死量(LD50)评价分离菌的致病性，取30只雄性昆明小鼠，随机分为6组，每组5只，其中5组作为攻毒组，一组作为对照组。浓缩菌液，调整菌液初始浓度为1.0×1010CFU/mL，进行10倍倍比稀释，选取100～10-45个梯度，每个梯度攻毒一组小鼠，腹腔注射菌液0.2 mL，对照组腹腔注射0.2 mL生理盐水。连续观察14 d，记录各组死亡情况，对死亡小鼠立即解剖，观察病变情况，进行各脏器细菌分离、鉴定。根据Reed-Muench累加法计算分离菌株的LD50[10-11]。

2 结果与分析

2.1 细菌分离 20份脑组织分别接种TSA平板，通过挑选可疑菌落，对其纯化，总共分出10株疑似菌株。在平板上可见灰白色、半透明、表面光滑、圆形、边缘整齐的小菌落。

2.2 细菌鉴定 分离的10株细菌，用猪链球菌属引物gdh进行PCR鉴定，其中3株能扩增出约695 bp大小的条带，分别回收PCR产物进行测序，在NCBI上进行BLAST比对，显示与猪链球菌对应的序列同源性在95%以上，说明分离菌株为猪链球菌(图1)。

2.3 2型猪链球菌PCR鉴定 3株猪链球菌经过cas2J引物PCR鉴定，1株能扩增出长度约为387 bp大小的条带，回收PCR产物进行测序，发现所测序列片段大小和预期片段大小相同，同时把测出的序列结果在NCBI上进行BLAST比对，显示与对应血清型的序列同源性在95%以上，说明所扩增的基因即为目的基因(图2)。

M:DL2000 DNA Marker;1-10:疑似菌株;11:阴性对照 M:DL2000 DNA Marker;1-10:suspicious strain；11:Negative control图1 猪链球菌PCR鉴定结果Fig 1 PCR identification results for Streptococcus suis

M:DL2000 DNA Marker;1-3:猪链球菌;4:阴性对照 M:DL2000 DNA Marker;1-3:Streptococcus suis;4:Negative control图2 2型猪链球菌PCR鉴定结果Fig 2 PCR identification results for Streptococcus suistype 2

2.4 毒力因子鉴定 分离的1株2型猪链球菌通过 PCR检测了mrp、epf、sly、orf2、gapdh、fbps和89k 7种毒力因子，结果7种毒力因子在分离菌株中都能检测到(图3)。对上述菌株毒力基因测序分析，结果发现所测序列片段大小和预期片段大小相同，同时把测出的序列结果在NCBI上进行BLAST比对，显示与对应的毒力因子序列同源性在95%以上，说明所扩增的基因即为目的基因，分离菌株基因中几种主要毒力因子都有分布。

2.5 形态学特性 分离的2型猪链球菌经过革兰氏染色后在显微镜下观察，细菌为革兰氏阴性细小杆菌，具有多种不同形态，可见单个的球杆菌、杆菌或丝状的菌体(图4)。

2.6 生长曲线绘制 在液体TSB培养基中培养分离菌株，分离菌6 h左右开始进入对数生长期，培养8～10 h活菌数达到最高峰，但从10 h开始活菌数一直呈现下降趋势。分离菌株在TSB液体培养基繁殖速度快，活菌数高(图5)。

2.7 小鼠攻毒试验 昆明小鼠腹腔注射不同浓度的菌液后，试验小鼠最早于攻毒后第1天开始出现死亡现象，死亡高峰出现在攻毒后2～5 d，7 d后停止死亡。按Reed-Muench法计算，分离2型猪链球菌的LD50见表2。将浓缩菌液稀释到4.8×107CFU/mL，攻毒0.2 mL，能使半数小鼠发生死亡，表明分离菌株毒力较强。

图4 革兰氏染色结果(100×)Fig 4 The results of Gram stain(100×)

图5 2型猪链球菌生长曲线Fig 5 The growth curve of Streptococcus suis type 2

表2 半数致死量(LD50)试验结果Tab 2 The results of LD50

2.8 剖检观察 剖检攻毒死亡小鼠，可见攻毒小鼠腹腔内渗出液增多，脑和各脏器出血；试验结束后剖检空白对照组小鼠，可见健康对照组小鼠腹腔及各器官正常。结果见图6。分离的2型猪链球菌能引起小鼠的急性败血症及脑膜炎，导致小鼠死亡，成功在小鼠上建立攻毒模型。

图6 剖检结果Fig 6 The results of anatomy

2.9 脏器细菌分离 剖检死亡小鼠，取各脏器在无菌操作台内进行细菌分离，结果显示攻毒后死亡小鼠各脏器均能分离出细菌。对各脏器分离的细菌进行PCR鉴定并测序，结果表明各脏器分离菌株均为攻毒2型猪链球菌(图7)。

图7 攻毒小鼠各脏器细菌分离鉴定Fig 7 Isolation and identification of bacteria from various organs of challenged mice

3 讨论与小结

猪链球菌是一种重要的人畜共患病病原，其致病性差异很大，只有高致病力菌株才能引起猪脑膜炎、关节炎、心内膜炎、败血症、肺炎和突然死亡等症状，低致病力和无致病力的菌株常见于猪的呼吸道。在致病性血清型中2 型的致病力最强，发病率最高，流行范围最广，其致病性和它的毒力因子相关[12-13]。现有疫苗菌株分离年代都比较久远，保护效果有一定的降低。本研究采集最近几年疑似猪链球菌感染病例脑样品，经过平板分离和 PCR鉴定成功获得一株2型猪链球菌，PCR检测显示分离菌株基因中几种主要毒力因子都有分布，在TSB液体培养基繁殖速度快，活菌数高，能引起小鼠的急性败血症及脑膜炎导致小鼠死亡，证明分离株毒力强，是潜在的疫苗菌株。